Glikoz imhası gibi diğer metabolik yolların aksine, yağ asidi sentezi rutin olarak değerlendirilmez ve bu da metabolik durumun eksik yorumlanmasına yol açar. Bu yöntemin temel faydaları, nispeten invaziv olmaması ve muhtemelen yağ asidi sentezi akısının, yukarı akış glikoz kullanımındaki değişikliklerin sonuçları etkileyebileceği izotop etiketli glikoz kullanmaktan daha iyi bir yansımasıdır. Burada, kahverengi yağ dokusuna odaklanıyoruz, ancak bu yöntem, herhangi bir fare modelindeki herhangi bir dokuyu incelemek için potansiyel olarak yararlıdır.
Başlamak için numuneleri kuru buz üzerine yerleştirin. Önceden etiketlenmiş bir mikrosantrifüj tüpü alın, analitik bir teraziye yerleştirin ve terazinin darasını alın. Ardından cımbız ve neşter veya çelik tıraş bıçağını soğuması için 10 ila 20 saniye kuru buz üzerine yerleştirin.
Donmuş doku örneğini tüpten çıkarmak için cımbız kullanın ve düz bir kuru buz bloğu veya önceden soğutulmuş başka bir yüzey üzerine yerleştirilebilen plastik bir ağırlık teknesine yerleştirin. Neşter veya çelik tıraş bıçağı kullanarak, 5 ila 15 miligram ağırlığa eşdeğer dokunun küçük bir kısmını inceleyin ve mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Tam ağırlığı kaydedin ve her numune için tekrarlayın.
10 milimolar heksadekanoik D31 asidin miligramı başına bir mikrolitre ekleyin, ardından her numuneye üç beş milimetre paslanmaz çelik boncuk ekleyin. Daha sonra boncuklu her numuneye 250 mikrolitre metanol, 250 mikrolitre su ve 500 mikrolitre kloroform ekleyin. Tüpleri önceden soğutulmuş bir öğütme değirmeni bloğuna yerleştirin ve numuneleri beş dakika boyunca 25 hertz'lik bir titreşim frekansında karıştırın.
Bir mıknatıs kullanarak boncukları çıkarın ve numuneleri 12.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Bir mikropipet kullanarak, her numunenin alt fazının sabit bir hacmini uygun şekilde etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine alın. Kalan numuneye 500 mikrolitre kloroform ekleyin ve bu adımları tekrarlayın.
Kombine alt fazlı tüpleri nitrojen gazı altına veya tamamen kuruyana kadar dört santigrat derecede kloroforma dayanıklı soğutmalı santrifüj vakuma yerleştirin. 98 mililitre susuz metanolü bir cam ortam şişesine pipetleyin. Ve metanolde %2 sülfürik asit yapmak için çeker ocakta yavaşça iki mililitre susuz sülfürik asit ekleyin.
Kapalı şişeyi döndürerek karıştırın. Her numuneye metanol çözeltisi içinde bu %2 sülfürik asitten 500 mikrolitre ekleyin ve kısaca vorteksleyin. Numuneleri ısı bloğunda 50 santigrat derecede iki saat inkübe edin ve her numuneye 100 mikrolitre doymuş sodyum klorür çözeltisi ve 500 mikrolitre heksan ekleyin.
Numuneleri oda sıcaklığında bir dakika kuvvetlice vorteksleyin ve numuneleri bir dakika bekletin. Bundan sonra iki aşama belirgin olmalıdır. Üst fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın.
Ardından heksan ilavesini tekrarlayın. Faz ayrımından sonra, ikinci üst faz numunelerini aynı etiketli tüplerde toplayın. Numuneleri oda sıcaklığında nitrojen gazı altında kurutun ve numuneleri orijinal doku ağırlığının miligramı başına 20 mikrolitre heksan içinde yeniden süspanse edin.
Numuneleri hemen bir cam ek parçalı bir cam gaz kromatografi şişesine aktarın. Yağ asidi metil esterlerinin veya FAME izotopologlarının bolluğunu belirlemek için numuneleri tek bir dörtlü gaz kromatografisi kütle spektrometresine enjekte edin. Taşıyıcı gaz olarak helyum kullanarak 270 santigrat derece giriş sıcaklığında bölünmüş veya bölünmemiş bir girişe bir mikrolitre numune enjekte edin.
Etiketli güvenli kilitli mikrosantrifüj tüplerinde, her plazma örneğinin 10 mikrolitresini veya standart dört mikrolitre 10 molar sodyum hidroksit ve dört mikrolitre% 5 asetonu asetonitrilde birleştirin. Bunu her örnek için üç kopya halinde gerçekleştirin. Numuneleri gece boyunca oda sıcaklığında inkübe ettikten sonra, her numuneye 450 ila 550 miligram sodyum sülfat ekleyin, çeker ocaktaki her tüpe 600 mikrolitre kloroform ekleyin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın.
Numuneleri 300 G'de iki dakika santrifüjleyin. Etiketli cam GCMS şişelerini cam eklerle alın ve her numuneden süpernatantın üçlü ve ardından 80 mikrolitrelik alikotlarını şişelere aktarın. GCMS analizi için şişeleri sıkıca kapatın.
Birden fazla zaman noktasında farelerin plazmasındaki D2O zenginleşmesinin yüzdesi burada gösterilmektedir. Vücut suyunun %2,5 ila %6 aralığında zenginleştirildiği, vücut suyunda temel bir döteryum zenginleştirme seviyesine bir saat içinde hızla ulaşıldığı ve çalışma süresince korunduğu bulunmuştur. Oda sıcaklığında ve termonötritede üç günlük D2O uygulamasından sonra palmitatın kahverengi yağ dokusunda kütle izotopolog dağılımı burada gösterilmektedir.
Bu sonuç, oda sıcaklığında daha yüksek bir M1 ve M2 döteryum zenginleşmesi göstermektedir. Bu şekilde, oda sıcaklığında ve termonötritede üç günlük D2O uygulamasından sonra bir dizi yağ asidinin kahverengi yağ dokusu molar yönünden zenginleştirilmesi ve plazma molar zenginleştirilmesi sunulmaktadır. Daha soğuk sıcaklıkta zenginleşme, kahverengi yağ dokusunda çok çeşitli yağ asitlerinde bulundu.
Özellikle, plazma toplam yağ asidi zenginleşmesi, kahverengi yağ dokusu ile aynı eğilimi izlemez, bunun yerine, yağ asidi zenginleştirmesi termonötralite ile artar. Bu görüntüler, üç günlük D2O uygulamasından sonra kahverengi yağ dokusunda toplam bolluğu ve de novo sentezlenmiş palmitatı temsil eder. Sonuç, oda sıcaklığında toplam palmitat sentezinde bir artış olduğunu gösterir.
GCMS'de yağ asitleri çalıştırırken dikkatli olun. Palmitatın aşırı yüklenmediğinden emin olun, çünkü yapay olarak yüksek izotop zenginleştirme değerleri verebilir. Ek olarak, GCMS'de asetonu analiz ederken, örnekleri çalıştırmadan önce arka plan aseton tepe noktası olmadığından emin olun, bu nedenle sistemdeki asetonu çıkarmak için boşlukları çalıştırın.
Bu yöntem, birden fazla lipit sınıfındaki toplam yağ asitlerine bakar, ancak yağ asidi sentezinin belirli lipit sınıflarını nasıl etkilediğini anlamak istiyorsanız, önce bu lipit sınıflarını kromatografi kullanarak ayırabilir ve ardından bu fraksiyonlardan yağ asitlerini çıkarabilirsiniz. Lipogenez normal gelişime ve aynı zamanda birçok hastalığa önemli bir katkıda bulunduğundan, bu protokol birçok alanda yararlı olabilir.
