文献报告了关于心肌B细胞患病率的对比数据。这可能源于灌注和消化技术的可变性。我们的方案能够对心肌B细胞进行可重复的流式细胞术分析。
该技术最大限度地提高了B细胞的回收率，并减少了B细胞和其他心脏样本群体之间流式细胞术计数的变异性。这种优化的消化和分离方法可以很容易地修改，以实现扩展的抗体组合，以研究心脏中的不同免疫细胞类型。该方案也可以应用于其他器官，如肺或肝，以研究与这些器官相关的B细胞。
首先，称一只 12 周大的雄性小鼠。用 100 微升 B220 抗体溶液加载 310-cc 胰岛素注射器。通过眶后注射注射稀释的B220抗体，并立即进行器官摘取和灌注。
安乐死后，在上腹部用镊子握住小鼠的皮肤。用剪刀在皮肤上开一个两毫米的开口，用镊子剥开皮肤，露出筋膜层。在上腹部通过筋膜和腹膜切割。
使用止血钳夹住剑突。在每侧锁骨中线水平处垂直切开胸壁，抬起前胸壁以显示纵隔内容物。使用镊子从后面牢固地握住主动脉。
将注射器针头引入心脏顶点。以每分钟三毫升的速度灌注三毫升HBSS。切开主动脉并取出心脏。
用HBSS在培养皿中清洗心脏。称量孤立的心脏并注意以毫克为单位的重量。用刀片在室温下将心脏切成小块。
心形碎片的大小应约为 1.5 毫米。使用天平测量心脏组织的质量，并将60毫克切碎的心脏放入15毫升管中，用3毫升HBSS冰上消化。对未接受B220抗体注射的小鼠重复此过程，并将其放入装有3毫升HBSS标记的参比对照组织的管中。
向每个含有碎组织的试管中添加酶。每毫克 DNase I 添加 0.5 微升，每毫克胶原酶 II 添加 0.5 微升，每毫克透明质酸酶添加 0.2 微升。将消化反应以每分钟300转的速度放入摇床中30分钟。
将管子以小角度放置在振动器中，倾斜度约为25度。向每个 15 毫升反应管中加入 7 毫升 HBSS，并在 4 摄氏度下以 250 G 离心 5 分钟。倾析上清液后，将每个沉淀重悬于5毫升ACK裂解缓冲液中。
在室温下孵育五分钟。向每个管中加入 10 毫升 PBS 后，混合并过滤到带有 50 微米过滤器的 40 毫升管中。用注射器柱塞粉碎过滤器上的任何碎屑，以确保所有材料都通过过滤器。
通过过滤器添加PBS直到体积达到每颗心脏25毫升后，向参考对照组织管中额外添加25毫升PBS，并将体积分成两个不同的管。标记其中一个未染色的管子和另一个活的/死的。在4摄氏度下以250G离心5分钟后，倒出上清液并将未染色的管重悬于100微升PBS中，并将其他每个沉淀重悬于100微升活/死染色溶液中。
在黑暗中在冰上孵育30分钟。向每个样品中加入500微升FACS缓冲液后，通过40微米过滤器将其转移到FACS管中。在4摄氏度下拒绝250G的FACS管五分钟并丢弃上清液后，将沉淀重悬于500微升FACS缓冲液中。
向每个试管中加入50微升FC封闭溶液，未染色和活/死管除外。混合并孵育五分钟。向每个试管中加入50微升抗体混合溶液后，除未染色和活/死管外，在黑暗中孵育30分钟，用铝箔覆盖冰桶。
与活/死污渍一样，用500微升FACS缓冲液再次洗涤，并重悬于300至500微升FACS缓冲液中。打开仪器控制软件。在窗口顶部，选择"获取"选项卡，然后单击"新建"。
在库部分的"要过滤的类型"字段中，键入 PE、PerCP-Cy5.5、亮紫 421、Alexa Fluor 700 和 Zombie Aqua，选择氟-4 并在键入每个后单击添加。然后，单击下一步进入组选项卡。现在单击带有管子的符号以添加用于分析的心脏。
单击引用组，将显示一个窗口。在荧光标签列中，选择 Zombie Aqua 作为荧光标签，通过单击每个标签旁边的垃圾红色图标删除任何其他标签。然后，在"控件类型"图标中，选择"单元格"。
然后，单击保存。单击下一步。然后，单击标记选项卡。
将显示一个表格。在每个氟-4列的第一行中键入相应的单元格标记，然后按Enter键。 单击"下一步"两次以转到"获取"选项卡。
在实验样本的要记录的事件中，键入 1000 万，在参考组行的同一字段中键入 200， 000。单击保存并打开。在左下角，单击仪器控制。
将电压设置为 FSC 50、SSC 175、SSC-B 175。选择采集控件。对于流速选项，请从下拉菜单中选择高。
涡旋未染色的心脏管并将其牢固地放置在样品进样口上。确保绿色指示器箭头指向正确的样品。然后，单击记录并等待事件被记录。
对活/死染色的心脏组织做同样的事情。选择"取消混合"菜单并设置控件。选中"自发荧光作为荧光标签"复选框。
然后，单击下一步进入识别正/负总体选项卡。在此选项卡中，将显示前向散射区域与侧向散射区域的图。单击并拖动多边形的点，以在前向散点区域轴上选择 1 到 400 万之间的区域，在侧散点区域轴上选择 0.2 到 300 万之间的区域。
在右侧的下一个图中，V5-A 将显示在 X 轴上。移动门以选择最右侧的一半峰值为正，将图左侧的区域选为负。在标题为"参考组 - 未染色"的图中，选择类似范围内的总体。
对于未染色的，不得选择阳性/阴性。点击 现场解混 按钮。现在获取实验样品，涡旋管，并将其牢固地放置在SIP上。
确保绿色指示器箭头指向正确的样品。然后，单击细胞仪软件的采集控制面板中的记录，并等待记录事件。选择"默认未混合工作表"选项卡。
使用顶部的点图工具创建 FCS-A 与 SSC-A 图。使用面选择工具在 FSC-A 轴上选择大于 40 万的事件，在 SSC-A 轴上选择高于 80 万的事件。通过双击选区创建新图解，在此新图解中，右键单击 Y 轴标签并选择活/死染色。
右键单击 X 轴标签并选择自发荧光 A.选择活/死轴上低于 10 到第五的所有事件。这些是活细胞。双击此选择。
在新图中，选择 PerCP-Cy5.5A 作为 X 轴，选择 SSC-A 作为 Y 轴。选择PerCP-Cy5.5A右侧的种群。这些是免疫细胞。
双击所选内容。在新图上，为 X 轴选择 FSC-A，为 Y 轴选择前向散射高度。选择遵循 FSC-A 值和 SSC-A 值相同的趋势的事件。
这将选择单个细胞并消除双峰。双击此选择以在CD45阳性单细胞群中显示新图。从 CD45 阳性单细胞群图中，在 X 轴上选择明亮的紫色 421，在 Y 轴上选择 SSC-A。
选择亮紫色 421 轴上右侧的人口。这是B细胞群。在此群体中双击两次以创建两个具有 B 细胞群的新图。
设置第一个 B 细胞图，X 轴上有 PEA，Y 轴上有亮紫色 421A。右边的群体对应于血管间B细胞，左边的群体代表间质B细胞。同时选择两者。
设置第二个B细胞图，X轴上为Alexa Fluor 700A，Y轴上为SSC-A。左边的群体对应于CD11b阴性细胞，右边的事件对应于CD11b阳性细胞。右键单击每个部分，然后单击门属性。
单击"计数"和"父项"以显示事件数和父群体的百分比。记录事件数和百分比以进行进一步的数据分析。在去除幼稚的未受伤心脏中的双峰后，预计大约20%的CD45阳性细胞将是CD19阳性B细胞。
在这些细胞中，平均有5.5%位于间质空间。94.5%在血管内间隙。在心脏中发现的整个B细胞群中，只有约1.6%对应于基于表面标志物CD11b的B1细胞，其他98.4%对应于B2细胞。
当通过流式细胞术分析心肌B细胞时，按照方案正确灌注和切碎心脏至关重要。消化的心脏的适当过滤对于最大限度地恢复免疫细胞也至关重要。
