В литературе приводятся контрастные данные о распространенности В-клеток миокарда. Это, вероятно, связано с изменчивостью методов перфузии и пищеварения. Наш протокол позволяет проводить воспроизводимый анализ на основе проточной цитометрии на В-клетках миокарда.
Этот метод максимизирует восстановительный выход В-клеток и снижает изменчивость количества проточной цитометрии среди В-клеток и других популяций из образцов сердца. Этот оптимизированный метод пищеварения и выделения может быть легко модифицирован для реализации расширенной панели антител для изучения различных типов иммунных клеток в сердце. Протокол также может быть применен к другим органам, таким как легкие или печень, для изучения В-клеток, связанных с этими органами.
Для начала взвесьте 12-недельного самца мыши. Нагрузите 310-кубовый инсулиновый шприц 100 микролитрами раствора антител B220. Вводят разбавленное антитело B220 путем ретроорбитальной инъекции и своевременно приступают к извлечению органов и перфузии.
После эвтаназии подержите кожу мыши щипцами в эпигастральной области. Сделайте двухмиллиметровое отверстие в коже с помощью ножниц и используйте щипцы, чтобы очистить кожу, чтобы раскрыть слой фасции. Разрезать эпигастрий через фасцию и брюшину.
Зажмите мечевидный отросток с помощью гемостатических щипцов. Сделайте вертикальный разрез через грудную стенку на уровне среднеклавикулярной линии с каждой стороны и поднимите переднюю стенку грудной клетки, чтобы раскрыть содержимое средостения. Надежно удерживайте аорту сзади с помощью щипцов.
Введите шприцевую иглу в верхушку сердца. Перфузируется тремя миллилитрами HBSS со скоростью три миллилитра в минуту. Отрежьте аорту и удалите сердце.
Вымойте сердце в чашке Петри с помощью HBSS. Взвесьте изолированное сердце и отметьте вес в миллиграммах. Измельчите сердце при комнатной температуре на мелкие кусочки лезвием.
Кусочки сердца должны быть размером около 1,5 миллиметра. Измерьте массу сердечной ткани с помощью баланса и поместите 60 миллиграммов измельченного сердца для переваривания в 15-миллилитровую трубку на льду с тремя миллилитрами HBSS. Повторите этот процесс для мыши, которая не получала инъекцию антитела B220, и поместите ее в пробирку с тремя миллилитрами меченной HBSS контрольной ткани.
Добавьте ферменты в каждую трубку, содержащую измельченные ткани. Добавьте 0,5 микролитра на миллиграмм ДНКазы I, один 0,5 микролитра на миллиграмм коллагеназы II и 0,2 микролитра на миллиграмм гиалуронидазы. Поместите реакцию пищеварения в шейкер на 30 минут со скоростью 300 оборотов в минуту.
Трубки помещают в шейкер под небольшим углом, около 25 градусов наклона. Добавьте семь миллилитров HBSS в каждую из 15-миллилитровых реакционных трубок и центрифугу при 250 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После декантирования супернатанта повторно суспендируйте каждую гранулу в пяти миллилитрах буфера лизиса ACK.
Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. После добавления 10 миллилитров PBS в каждую трубку перемешайте и отфильтруйте в 50-миллилитровую трубку с 40-микрометровым сетчатым фильтром. Разбейте любой мусор на фильтре с помощью шприцевого плунжера, чтобы убедиться, что весь материал проходит через фильтр.
После добавления PBS через фильтр до тех пор, пока объем не достигнет 25 миллилитров на сердце, добавьте дополнительные 25 миллилитров PBS в эталонную контрольную тканевую трубку и разделите объем на две разные трубки. Пометьте одну из трубок незапятнанной, а другую живой/мертвой. После центрифугирования при 250 Г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия декантируют супернатант и повторно суспендируют неокрашенную трубку в 100 микролитрах PBS и каждую из других гранул в 100 микролитрах живого/мертвого раствора пятна.
Насиживать на льду в течение 30 минут в темноте. После добавления 500 микролитров буфера FACS к каждому образцу перенесите его в трубку FACS через 40-микрометровый фильтр. После отказа от пробирок FACS при 250 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и выброса супернатанта повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах буфера FACS.
Добавьте 50 микролитров блокатора FC в каждую трубку, за исключением неокрашенных и живых/мертвых трубок. Перемешать и инкубировать в течение пяти минут. После добавления 50 микролитров раствора смеси антител в каждую пробирку, за исключением неокрашенных и живых/мертвых трубок, инкубируют в течение 30 минут в темноте, покрывая ведро со льдом алюминиевой фольгой.
Как и в случае с живым/мертвым пятном, снова промыть 500 микролитрами буфера FACS и повторно суспендировать в 300-500 микролитрах буфера FACS. Откройте программное обеспечение управления прибором. В верхней части окна выберите вкладку Приобретение и нажмите создать.
В разделе библиотеки в поле Тип для фильтрации введите PE, PerCP-Cy5.5, бриллиантовый фиолетовый 421, Alexa Fluor 700 и Zombie Aqua, выбрав фтор-4 и нажав кнопку Добавить после ввода каждого из них. Затем нажмите кнопку Далее, чтобы перейти на вкладку Группы. Теперь нажмите на символ с трубкой, чтобы добавить сердце для анализа.
Нажмите на ссылочную группу, и появится окно. В столбце флуоресцентных тегов выберите Zombie Aqua в качестве флуоресцентного тега, удалив все остальные, щелкнув красный значок корзины рядом с каждым из них. Затем на значке Тип элемента управления выберите Ячейки.
Затем нажмите кнопку Сохранить. Нажмите кнопку Далее. Затем перейдите на вкладку Маркеры.
Отобразится таблица. Введите соответствующий маркер ячейки в первой строке каждого столбца fluoro-4 и нажмите клавишу ВВОД. Дважды нажмите кнопку Далее, чтобы перейти на вкладку Приобретение.
В разделе События для записи экспериментальных образцов введите 10 миллионов, а в том же поле для линии контрольной группы введите 200 000. Нажмите кнопку Сохранить и открыть. В левом нижнем углу нажмите на Управление приборами.
Установите напряжение на FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Выберите Элемент управления приобретением. Для параметра Скорость потока выберите Высокий в раскрывающемся меню.
Вихрьте незапятнанную сердечную трубку и надежно поместите ее на отверстие для инъекций образца. Убедитесь, что зеленая стрелка индикатора указывает на правильный образец. Затем нажмите кнопку Запись и дождитесь записи событий.
Сделайте то же самое для живой / мертвой окрашенной сердечной ткани. Выберите меню Unmix и установите элементы управления. Установите флажок Автофлуоресценция в качестве флуоресцентной метки.
Затем нажмите кнопку Далее, чтобы перейти на вкладку Определение положительных/отрицательных групп населения. На этой вкладке будет отображаться график прямой области рассеяния по сравнению с областью бокового рассеяния. Щелкните и перетащите точки многоугольника, чтобы выбрать область от 1 до 4 миллионов на передней оси области рассеяния и от 0,2 до 3 миллионов на боковой оси области рассеяния.
На следующем графике справа V5-A будет отображаться по оси X. Переместите ворота, чтобы выбрать половину пика справа как положительную, а область в левой части графика как отрицательную. На графике под названием Reference Group-Unstained выберите популяцию в аналогичном диапазоне.
Для незапятнанных не должно быть выбрано положительное/отрицательное. Нажмите кнопку Live Unmixing .. Теперь возьмите экспериментальные образцы, вихрьте трубку и надежно поместите ее на SIP.
Убедитесь, что зеленая стрелка индикатора указывает на правильный образец. Затем нажмите кнопку «Запись» на панели управления приобретением программного обеспечения цитометра и дождитесь записи событий. Выберите вкладку Несмешанный лист по умолчанию.
Создайте график FCS-A и SSC-A с помощью инструмента точечной диаграммы сверху. С помощью инструмента выделения полигонов выберите события свыше 0,4 миллиона на оси FSC-A и более 0,8 миллиона на оси SSC-A. Создайте новый график, дважды щелкнув выделенную область, и на этом новом графике щелкните правой кнопкой мыши метку оси Y и выберите живое/ мертвое пятно.
Щелкните правой кнопкой мыши на метке оси X и выберите Автофлуоресценция A.Выберите все события ниже 10 до пятой на живой/мертвой оси. Это живые клетки. Дважды щелкните в этом выделении.
На новом графике выберите PerCP-Cy5.5A для оси X и SSC-A для оси Y. Выберите популяции с правой стороны PerCP-Cy5.5A. Это иммунные клетки.
Дважды щелкните по выделенной области. На новом графике выберите FSC-A для оси X и прямую высоту рассеяния для оси Y. Выберите события, следующие за тенденцией, в которой значения FSC-A и SSC-A совпадают.
При этом выделяются одиночные ячейки и удаляются дублеты. Дважды щелкните на этом выделении, чтобы отобразить новый график в CD45-положительной одноклеточной популяции. Из CD45-положительного графика одноклеточной популяции выберите блестящий фиолетовый 421 на оси X против SSC-A на оси Y.
Выберите популяцию справа на блестящей фиолетовой оси 421. Это популяция В-клеток. Дважды щелкните в этой популяции, чтобы создать два новых участка с популяцией В-клеток.
Настройте первый график B-клеток с PEA по оси X и блестящим фиолетовым 421A по оси Y. Популяция справа соответствует межсосудистым В-клеткам, а популяция слева представляет собой интерстициальные В-клетки. Выберите оба варианта.
Настройте второй график B-ячеек с Alexa Fluor 700A по оси X и SSC-A по оси Y. Популяция слева соответствует CD11b-отрицательным клеткам, а события справа соответствуют CD11b-положительным клеткам. Щелкните правой кнопкой мыши каждый раздел и выберите свойства Gate.
Нажмите «Количество и родитель», чтобы отобразить количество событий и процент родительской популяции. Запишите количество событий и проценты для дальнейшего анализа данных. После удаления дублетов в наивном неповрежденном сердце ожидается, что около 20% CD45-положительных клеток будут CD19-положительными В-клетками.
Из этих клеток в среднем 5,5% располагаются в интерстициальном пространстве. 94,5% находятся во внутрисосудистом пространстве. Из всей популяции В-клеток, обнаруженных в сердце, только около 1,6% соответствует клеткам B1 на основе поверхностного маркера CD11b, а остальные 98,4% соответствуют клеткам B2.
При анализе В-клеток миокарда с помощью проточной цитометрии крайне важно правильно перфузировать и измельчать сердце в соответствии с протоколом. Правильная фильтрация переваренного сердца также необходима для максимального восстановления иммунных клеток.
