문헌은 심근 B 세포의 유병률에 대한 대조적인 데이터를 보고합니다. 이것은 관류 및 소화 기술의 다양성에서 비롯된 것 같습니다. 당사의 프로토콜은 심근 B 세포에 대한 재현 가능한 유세포 분석 기반 분석을 지원합니다.
이 기술은 B 세포의 회수 수율을 극대화하고 B 세포 및 심장 샘플의 다른 집단 간의 유세포 분석 수의 변동성을 줄입니다. 이 최적화된 분해 및 분리 방법은 심장의 다양한 면역 세포 유형을 연구하기 위해 확장된 항체 패널을 구현하도록 쉽게 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 폐 또는 간과 같은 다른 기관에도 적용하여 해당 기관과 관련된 B 세포를 연구 할 수 있습니다.
시작하려면 12 주 된 수컷 마우스의 무게를 측정하십시오. 310cc 인슐린 주사기에 100마이크로리터의 B220 항체 용액을 로드합니다. 희석된 B220 항체를 역궤도 주입으로 주입하고 즉시 장기 적출 및 관류를 진행합니다.
안락사 후, 상복부 부위에서 집게로 마우스의 피부를 잡으십시오. 가위를 사용하여 피부에 2mm 구멍을 만들고 집게를 사용하여 피부를 벗겨 근막 층을 드러냅니다. 근막과 복막을 통해 상복부를 자릅니다.
지혈 집게를 사용하여 검상돌기를 고정하십시오. 양쪽의 쇄골 중간 선 수준에서 흉벽을 수직으로 자르고 전방 흉벽을 들어 올려 종격동 내용물을 드러냅니다. 집게를 사용하여 대동맥을 뒤에서 단단히 잡으십시오.
주사기 바늘을 심장의 정점에 삽입하십시오. 분당 3 밀리리터의 속도로 3 밀리리터의 HBSS로 관류됩니다. 대동맥을 자르고 심장을 제거하십시오.
HBSS로 페트리 접시에 담긴 심장을 씻으십시오. 고립 된 심장의 무게를 측정하고 밀리그램 단위의 무게를 기록하십시오. 실온에서 심장을 칼날로 작은 조각으로 만듭니다.
심장 조각의 크기는 약 1.5 밀리미터 여야합니다. 저울을 사용하여 심장 조직의 질량을 측정하고 다진 심장 60mg을 HBSS 3ml와 함께 얼음 위의 15 밀리리터 튜브에 넣습니다. B220 항체 주사를 받지 않은 마우스에 대해 이 과정을 반복하고 HBSS 표지된 기준 대조 조직 3밀리리터와 함께 튜브에 넣습니다.
다진 조직이 들어있는 각 튜브에 효소를 첨가하십시오. DNase I 밀리그램 당 0.5 마이크로 리터, 콜라게나제 II 밀리그램 당 0.5 마이크로 리터 및 히알루로니다 제 밀리그램 당 0.2 마이크로 리터를 첨가하십시오. 소화 반응을 분당 300 회전으로 30 분 동안 셰이커에 놓습니다.
튜브는 약 25도 경사의 작은 각도로 셰이커에 배치됩니다. 15밀리리터 반응 튜브 각각에 HBSS 7밀리리터를 넣고 섭씨 4도에서 5분 동안 250G로 원심분리합니다. 상청액을 디캔팅한 후 각 펠릿을 5밀리리터의 ACK 용해 완충액에 재현탁합니다.
실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 각 튜브에 10 밀리리터의 PBS를 첨가 한 후 40 마이크로 미터 스트레이너가있는 50 밀리리터 튜브에 혼합하고 여과합니다. 주사기 플런저로 필터의 파편을 부수어 모든 재료가 필터를 통과하도록 합니다.
부피가 심장당 25밀리리터에 도달할 때까지 필터를 통해 PBS를 추가한 후 기준 대조 조직 튜브에 25밀리리터의 PBS를 추가하고 부피를 두 개의 다른 튜브로 나눕니다. 튜브 중 하나는 얼룩이 없고 다른 하나는 살아/죽은 것으로 표시합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 250G에서 원심분리한 후, 상청액을 디캔트하고 염색되지 않은 튜브를 100마이크로리터의 PBS에 재현탁하고 각각의 다른 펠릿을 100마이크로리터의 살아있는/죽은 염색 용액에 재현탁합니다.
어둠 속에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하십시오. 각 샘플에 500 마이크로 리터의 FACS 버퍼를 추가 한 후 40 마이크로 미터 필터를 통해 FACS 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 250G에서 FACS 튜브를 거부하고 상청액을 버린 후, 펠렛을 500 마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁시켰다.
염색되지 않은 튜브와 살아있는/죽은 튜브를 제외한 각 튜브에 50마이크로리터의 FC 차단 용액을 추가합니다. 5 분 동안 혼합하고 배양하십시오. 염색되지 않은 살아있는 / 죽은 튜브를 제외하고 각 튜브에 50 마이크로 리터의 항체 혼합 용액을 추가 한 후 얼음 통을 알루미늄 호일로 덮고 어둠 속에서 30 분 동안 배양합니다.
살아있는 / 죽은 얼룩과 마찬가지로 500 마이크로 리터의 FACS 완충액으로 다시 세척하고 300 내지 500 마이크로 리터의 FACS 완충액에 재현탁하십시오. 계측기 제어 소프트웨어를 엽니다. 창 상단에서 획득 탭을 선택하고 새로 만들기를 클릭합니다.
라이브러리 섹션의 필터링할 유형 필드에 PE, PerCP-Cy5.5, 브릴리언트 바이올렛 421, Alexa Fluor 700 및 좀비 아쿠아를 입력하고 플루오로-4를 선택하고 각각을 입력한 후 추가를 클릭합니다. 그런 다음 다음을 클릭하여 그룹 탭으로 이동합니다. 이제 튜브가있는 기호를 클릭하여 분석을위한 하트를 추가하십시오.
참조 그룹을 클릭하면 창이 표시됩니다. 형광 태그 열에서 형광 태그로 Zombie Aqua를 선택하고 각 태그 옆에 있는 빨간색 휴지통 아이콘을 클릭하여 다른 태그를 삭제합니다. 그런 다음 컨트롤 형식 아이콘에서 셀을 선택합니다.
그런 다음 저장을 클릭합니다. 다음을 클릭합니다. 그런 다음 마커 탭을 클릭합니다.
테이블이 표시됩니다. 각 fluoro-4 열의 첫 번째 행에 해당 셀 마커를 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 다음을 두 번 클릭하여 획득 탭으로 이동합니다.
실험 샘플의 기록할 이벤트에 1,000만 개를 입력하고 참조 그룹 줄에 대해 동일한 필드에 200, 000을 입력합니다. 저장 후 열기를 클릭합니다. 왼쪽 하단에서 악기 제어를 클릭합니다.
전압을 FSC 50, SSC 175, SSC-B 175로 설정합니다. 획득 컨트롤을 선택합니다. 유량 옵션의 경우 드롭다운 메뉴에서 높음을 선택합니다.
염색되지 않은 심장 튜브를 소용돌이 치고 샘플 주입 포트에 단단히 놓습니다. 녹색 표시기 화살표가 올바른 샘플을 가리키고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 녹화를 클릭하고 이벤트가 녹화될 때까지 기다립니다.
살아 있거나 죽은 염색 된 심장 조직에 대해서도 똑같이하십시오. Unmix 메뉴를 선택하고 컨트롤을 설정합니다. 형광 태그로 자동 형광 확인란을 선택합니다.
그런 다음 다음을 클릭하여 양성/음수 모집단 식별 탭으로 이동합니다. 이 탭에는 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역의 플롯이 표시됩니다. 다각형의 점을 클릭하고 드래그하여 전방 산란 영역 축에서 1-4백만 사이의 영역과 측면 산란 영역 축에서 0.2-3백만 사이의 영역을 선택합니다.
오른쪽의 다음 플롯에서 V5-A가 X 축에 표시됩니다. 게이트를 이동하여 맨 오른쪽에 있는 피크의 절반을 양수로 선택하고 플롯의 왼쪽에 있는 영역을 음수로 선택합니다. 참조 그룹-염색되지 않음이라는 제목의 플롯에서 유사한 범위의 모집단을 선택합니다.
염색되지 않은 경우 양성/음수를 선택해야 합니다. 라이브 믹싱 해제 버튼을 클릭합니다. 이제 실험 샘플을 획득하고 튜브를 와류시킨 다음 SIP에 단단히 놓습니다.
녹색 표시기 화살표가 올바른 샘플을 가리키고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 세포분석기 소프트웨어의 획득 제어판에서 기록을 클릭하고 이벤트가 기록될 때까지 기다립니다. 혼합되지 않은 기본 워크시트 탭을 선택합니다.
맨 위에 있는 점도표 도구를 사용하여 FCS-A 대 SSC-A 플롯을 생성합니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 FSC-A 축에서 40만 개 이상, SSC-A 축에서 80만 개 이상의 이벤트를 선택합니다. 선택 영역을 두 번 클릭하여 새 플롯을 만들고 이 새 플롯에서 Y축 레이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 라이브/데드 스테인을 선택합니다.
X축 레이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 자가형광 A.살아있는/죽은 축에서 10에서 다섯 번째 사이의 모든 이벤트를 선택합니다. 이들은 살아있는 세포입니다. 이 선택 항목을 두 번 클릭합니다.
새 플롯에서 X축에 대해 PerCP-Cy5.5A를 선택하고 Y축에 대해 SSC-A를 선택합니다. PerCP-Cy5.5A의 오른쪽에 있는 모집단을 선택합니다. 이들은 면역 세포입니다.
선택 항목을 두 번 클릭합니다. 새 플롯에서 X축에 대해 FSC-A를 선택하고 Y축에 대해 전방 산란 높이를 선택합니다. FSC-A 값과 SSC-A 값이 동일한 추세를 따르는 이벤트를 선택합니다.
이것은 단일 셀을 선택하고 이중선을 제거합니다. 이 선택 항목을 두 번 클릭하면 CD45 양성 단일 세포 집단에 새 그림이 표시됩니다. CD45 양성 단일 세포 모집단 플롯에서 X축의 브릴리언트 바이올렛 421과 Y축의 SSC-A를 선택합니다.
화려한 보라색 421 축에서 오른쪽의 인구를 선택합니다. 이것은 B 세포 집단입니다. 이 모집단을 두 번 두 번 클릭하여 B 셀 모집단이 있는 두 개의 새 플롯을 생성합니다.
X축에 PEA가 있고 Y축에 화려한 보라색 421A가 있는 첫 번째 B 셀 플롯을 설정합니다. 오른쪽의 집단은 혈관 간 B 세포에 해당하고 왼쪽의 집단은 간질 B 세포를 나타냅니다. 둘 다 선택합니다.
X축에 Alexa Fluor 700A가 있고 Y축에 SSC-A가 있는 두 번째 B 셀 플롯을 설정합니다. 왼쪽의 집단은 CD11b 음성 세포에 해당하고 오른쪽의 이벤트는 CD11b 양성 세포에 해당합니다. 각 섹션을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 게이트 속성을 클릭합니다.
Count 및 Parent를 클릭하여 사건 수와 부모 모집단의 백분율을 표시합니다. 추가 데이터 분석을 위해 이벤트 수와 백분율을 기록합니다. 순진한 손상되지 않은 심장에서 이중선을 제거한 후 CD45 양성 세포의 약 20%가 CD19 양성 B 세포가 될 것으로 예상됩니다.
이 세포 중 평균 5.5 %틈새 공간에 있습니다. 94.5%혈관 내 공간에 있습니다. 심장에서 발견되는 전체 B 세포 집단에서 약 1.6 %표면 마커 CD11b를 기반으로 한 B1 세포에 해당하고 나머지 98.4 %는 B2 세포에 해당합니다.
유세포 분석을 통해 심근 B 세포를 분석 할 때 프로토콜에 따라 심장을 적절하게 관류하고 다지는 것이 중요합니다. 소화 된 심장의 적절한 여과는 면역 세포의 회복을 극대화하는 데 필수적입니다.
