使用该技术生成的数据进一步了解了自身免疫易发小鼠模型以及人源化小鼠，可用于一般抗体或抗体生命治疗。具有不断扩大的荧光团范围的试剂的可用性允许同时分析单个细胞上的多个参数，并能够评估B细胞异质性。该协议是针对基因工程小鼠进行表型而开发的。
以确定遗传操作是否会改变B细胞发育。嗨，我是菲丝·哈里斯。我今天将演示该过程。
首先将每只动物的每种细胞类型的100万个等分到96孔U底板中。确保所有样品和对照都有足够的孔可用，包括全染色，荧光减一样品和每个荧光团的未染色样品。对于骨髓成熟面板和脾脏成熟面板，将细胞等分到两个孔中，每孔100万个细胞用于每个完整的染色样品。
对于单色补偿活力对照，将每种细胞类型的200万个细胞添加到单个孔中。将板以845 x g在四摄氏度下离心两分钟。通过快速倒置并在水槽上轻拂板来倾倒上清液，注意不要交叉污染孔。
在200微升DPBS中洗涤细胞两次。每次洗涤后离心并倾析上清液。将细胞重悬于100微升以1至1000的比例稀释在DPBS中的活性染料中，避免用于单色补偿的细胞。
对于每个染色剂组，留出几个未染色的孔，用于完全未染色的样品和您可能需要的其他对照，以及一个额外的未染色孔，用于可行性FMO控制。将PBS添加到这些井中。将单色补偿活力对照的细胞重悬于200微升稀释的活力染料中。
将这些细胞的100微升转移到1.5毫升的微量离心管中，并在65摄氏度下加热5分钟，然后将加热的细胞与剩余的活细胞一起转移回原始孔中。将细胞在4摄氏度下孵育30分钟，避光。孵育后，离心细胞并通过轻拂或倒置板来倾倒上清液，而不会交叉污染其他孔。
通过重悬于200微升DPBS来洗涤细胞，然后像以前一样离心并倾析上清液。再次重复DPBS清洗。加入用污渍缓冲液稀释的微升FC块，以1比50的比例获得每毫升10微克的最终浓度。
对于腹膜细胞，加入五微升单核细胞阻滞剂以减少非特异性染色。然后，将细胞在4摄氏度下孵育15分钟，避光。使用文本手稿中的抗体表，在染色缓冲液中制备完整的染色前混合物和FMO，以获得每百万个细胞100微升的最终体积。
在不去除FC块的情况下，向选定的孔中加入100微升的全染色混合物和FMO。为每个抗体和染色剂组准备单色补偿对照。如果使用补偿珠，请遵循制造商的说明。
将细胞和珠子在4摄氏度下孵育30分钟，避光。然后，离心并通过倒置和轻拂板来倾析上清液。将细胞和珠子在200微升的染色缓冲液中洗涤三次，每次离心并倾析上清液。
将细胞和微球重悬于DPBS中的200微升2%多聚甲醛中，以固定样品进行分析。将细胞和珠子在4摄氏度下孵育30分钟，避光，然后离心并通过倒置或轻拂板来倾析上清液。将细胞和微珠重悬于200微升染色缓冲液中。
将滤板放在干净的96孔U底板上，并使用多管移液器将每个样品转移到滤板的孔中。离心滤板并倾析上清液。对于骨髓和脾脏成熟面板，将完全染色的细胞重悬于100微升染色缓冲液中。
将每只动物的两个孔合并成一个孔。将剩余的样品板、FMO和对照组重悬于200微升染色缓冲液中。将固定细胞和微珠在四摄氏度下孵育过夜，避光。
使用准备好的单一污渍补偿记录每个染色剂面板的补偿控制，并为每个样品设置正极和负极门。使用软件计算补偿矩阵。开始获取第一个样品，确保栅极设置正确。
设置机器运行并记录文本手稿中提到的每个样品的各种细胞事件。使用流式细胞术分析软件继续进行数据分析，遵循文本手稿中的门控策略。用于表征腹膜B细胞的流式细胞术分析显示了小鼠中活的腹膜细胞，总B细胞，B-1和B-2亚群以及B-1a和B-1b细胞的频率。
当分析骨髓B细胞时，测定小鼠中活细胞，总B细胞，A级，前B细胞，B级，C级，C'分馏D，未成熟E级，过渡级分E和F级B细胞的频率。对脾B细胞的分析显示了小鼠中活脾细胞，总B细胞，过渡B细胞，T1，T2，T3细胞，成熟B细胞，滤泡I细胞，滤泡II细胞，前体和成熟边缘区细胞以及B-1细胞的频率。通过对脾脏进行流式细胞术分析确定小鼠中免疫球蛋白kappa和免疫球蛋白λB细胞的频率。
执行此协议时，您需要使用补偿控制将来自一个检测器的信号解析为下一个检测器。这些对照可以是细胞单独染色或使用市售补偿珠。其他检测可以与流式细胞术结合使用，如免疫组织化学，以可视化淋巴器官内的细胞定位，以及两个光子显微镜，以分析B细胞在实时空间和时间中的反应。
B细胞区室的流式细胞术分析允许表征与BCR相关的表型和相关缺陷，BCR信号分子的扰动或调节B细胞存活的细胞因子的破坏。
