文献は、心筋B細胞の有病率に関する対照的なデータを報告しています。これはおそらく、灌流と消化技術のばらつきに起因しています。当社のプロトコルは、心筋B細胞の再現性のあるフローサイトメトリーベースの分析を可能にします。
この技術は、B細胞の回収率を最大化し、心臓サンプルからのB細胞および他の集団間のフローサイトメトリー数のばらつきを低減します。この最適化された消化および単離方法は、心臓のさまざまな免疫細胞タイプを研究するための拡張抗体パネルを実装するために簡単に変更できます。このプロトコルは、肺や肝臓などの他の臓器にも適用して、それらの臓器に関連するB細胞を研究することができます。
まず、12週齢のオスのマウスの体重を量ります。310 ccインスリン注射器に100マイクロリットルのB220抗体溶液をロードします。希釈したB220抗体を眼窩後注入で注入し、速やかに臓器摘出と灌流に進みます。
安楽死後、上腹部で鉗子でマウスの皮膚を保持します。ハサミを使って皮膚に2ミリメートルの開口部を作り、鉗子を使用して皮膚を剥がし、筋膜層を明らかにします。筋膜と腹膜を通して上腹部を切る。
止血鉗子を使用して剣状突起をクランプします。両側の中央鎖骨線の高さで胸壁を垂直に切り込み、前胸壁を持ち上げて縦隔の内容を明らかにします。鉗子を使用して大動脈を後ろからしっかりと保持します。
注射針を心臓の頂点に導入します。毎分3ミリリットルの速度で3ミリリットルのHBSSを灌流した。大動脈を切って心臓を取り除きます。
HBSSでペトリ皿の心臓を洗います。孤立した心臓の重さを量り、ミリグラム単位で体重を書き留めます。室温で心臓を刃で細かく刻みます。
ハートピースのサイズは約1.5ミリメートルでなければなりません。天びんを使用して心臓組織の質量を測定し、3ミリリットルのHBSSを入れた氷上の15ミリリットルのチューブに消化する60ミリグラムのミンチ心臓を置きます。B220抗体注射を受けなかったマウスに対してこのプロセスを繰り返し、3ミリリットルのHBSS標識参照対照組織を入れたチューブに入れます。
ミンチ組織を含む各チューブに酵素を追加します。DNase Iのミリグラムあたり0.5マイクロリットル、コラゲナーゼIIのミリグラムあたり1つの0.5マイクロリットル、およびヒアルロニダーゼのミリグラムあたり0.2マイクロリットルを追加します。消化反応をシェーカーに毎分300回転で30分間入れます。
チューブは、約25度の傾斜の小さな角度でシェーカーに配置されます。15ミリリットルの反応チューブのそれぞれに7ミリリットルのHBSSを加え、摂氏4度で5分間250Gで遠心分離します。上清をデカントした後、各ペレットを5ミリリットルのACK溶解バッファーに再懸濁します。
室温で5分間インキュベートします。各チューブに10ミリリットルのPBSを加えた後、40マイクロメートルのストレーナーで50ミリリットルのチューブに混合してろ過します。シリンジプランジャーでフィルターの破片を粉砕し、すべての材料がフィルターを通過するようにします。
容量が心臓あたり25ミリリットルに達するまでフィルターを通してPBSを追加した後、参照対照組織チューブにさらに25ミリリットルのPBSを追加し、ボリュームを2つの異なるチューブに分割します。チューブの1つに染色されていないラベルを付け、もう1つに生/死んでいるラベルを付けます。摂氏4度で250 Gで5分間遠心分離した後、上清をデカントし、染色されていないチューブを100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、他の各ペレットを100マイクロリットルの生/死染色溶液に再懸濁します。
暗闇の中で30分間氷上でインキュベートします。各サンプルに500マイクロリットルのFACSバッファーを加えた後、40マイクロメートルのフィルターを通してFACSチューブに移します。FACSチューブを摂氏4度で5分間250Gで拒否し、上清を廃棄した後、ペレットを500マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁します。
50マイクロリットルのFCブロッキング溶液を、染色されていないチューブと生きている/死んだチューブを除く各チューブに追加します。混合して5分間インキュベートします。染色されていないチューブと生/死のチューブを除く各チューブに50マイクロリットルの抗体混合溶液を加えた後、暗所で30分間インキュベートし、アイスバケットをアルミホイルで覆います。
生/死んだ汚れと同様に、500マイクロリットルのFACSバッファーで再度洗浄し、300〜500マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁します。計測器制御ソフトウェアを開きます。ウィンドウの上部で、[取得]タブを選択し、[新規]をクリックします。
ライブラリセクションの[フィルタリングするタイプ]フィールドに、PE、PerCP-Cy5.5、ブリリアントバイオレット421、Alexa Fluor 700、ゾンビアクアと入力し、フルオロ4を選択し、それぞれ入力した後に[追加]をクリックします。次に、[次へ] をクリックして [グループ] タブに進みます。次に、チューブ付きのシンボルをクリックして、分析用のハートを追加します。
参照グループをクリックすると、ウィンドウが表示されます。蛍光タグ列で、蛍光タグとしてゾンビアクアを選択し、それぞれの横にあるゴミ箱の赤いアイコンをクリックして他のタグを削除します。次に、[コントロールの種類] アイコンで [セル] を選択します。
次に、[保存] をクリックします。[次へ] をクリックします。次に、[マーカー] タブをクリックします。
テーブルが表示されます。各 fluoro-4 列の最初の行に対応するセルマーカーを入力し、Enter キーを押します。 [次へ] を 2 回クリックして、[取得] タブに移動します。
実験サンプルの記録するイベントに「1,000万」と入力し、参照グループ行の同じフィールドに「200, 000」と入力します。「保存して開く」をクリックします。左下の[計測器制御]をクリックします。
電圧をFSC 50、SSC 175、SSC-B 175に設定します。[取得コントロール]を選択します。流量オプションの場合は、ドロップダウンメニューから[高]を選択します。
染色されていない心臓チューブをボルテックスし、サンプル注入ポートにしっかりと置きます。緑色のインジケータ矢印が正しいサンプルを指していることを確認します。次に、[記録] をクリックし、イベントが記録されるまで待ちます。
生きている/死んだ染色された心臓組織についても同じことを行います。[アンミックス]メニューを選択し、コントロールを設定します。蛍光タグとしての自家蛍光のチェックボックスを選択します。
次に、[次へ]をクリックして、[ポジティブ/ネガティブ母集団の識別]タブに進みます。このタブには、前方散乱領域と側方散乱領域のプロットが表示されます。多角形のポイントをクリックしてドラッグし、前方散乱領域軸で 100 万から 400 万、側面散布領域軸で 0.2 から 300 万の領域を選択します。
右の次のプロットでは、V5-AがX軸に表示されます。ゲートを移動して、右端のピークの半分を正として選択し、プロットの左側の領域を負として選択します。参照グループ - 染色されていないというタイトルのプロットで、同様の範囲の母集団を選択します。
染色されていないものについては、ポジティブ/ネガティブを選択しないでください。「ライブアンミキシング」ボタンをクリックします。次に、実験サンプルを取得し、チューブをボルテックスして、SIPにしっかりと置きます。
緑色のインジケータ矢印が正しいサンプルを指していることを確認します。次に、サイトメーターソフトウェアの画像取り込みコントロールパネルで[記録]をクリックし、イベントが記録されるまで待ちます。デフォルトの混合されていないワークシートタブを選択します。
上部のドットプロットツールを使用して、FCS-A対SSC-Aプロットを作成します。ポリゴン選択ツールを使用して、FSC-A 軸で 40 万を超えるイベント、SSC-A 軸で 80 万を超えるイベントを選択します。選択をダブルクリックして新しいプロットを作成し、この新しいプロットでY軸ラベルを右クリックして、ライブ/デッドステインを選択します。
X軸ラベルを右クリックして、自家蛍光A.ライブ/デッド軸の10未満から5番目のすべてのイベントを選択します。これらは生細胞です。この選択をダブルクリックします。
新しいプロットで、X軸にPerCP-Cy5.5Aを選択し、Y軸にSSC-Aを選択します。PerCP-Cy5.5Aの右側の母集団を選択します。これらは免疫細胞です。
選択をダブルクリックします。新しいプロットで、X軸にFSC-Aを選択し、Y軸に前方散乱高さを選択します。FSC-A値とSSC-A値が同じトレンドに従うイベントを選択します。
これにより、単一セルが選択され、ダブレットが排除されます。この選択をダブルクリックすると、CD45陽性の単一細胞集団の新しいプロットが表示されます。CD45陽性の単一細胞集団プロットから、X軸のブリリアントバイオレット421とY軸のSSC-Aを選択します。
鮮やかな紫色の 421 軸の右側の人口を選択します。これがB細胞集団です。この母集団を2回ダブルクリックすると、B細胞母集団で2つの新しいプロットが作成されます。
X軸にPEAを、Y軸にブリリアントバイオレット421Aを使用して、最初のB細胞プロットを設定します。右側の集団は血管間B細胞に対応し、左側の集団は間質性B細胞を表します。両方を選択します。
Alexa Fluor 700AをX軸に、SSC-AをY軸にして2番目のB細胞プロットを設定します。左側の集団はCD11b陰性細胞に対応し、右側のイベントはCD11b陽性細胞に対応します。各セクションを右クリックし、[ゲートのプロパティ] をクリックします。
[カウント] と [親] をクリックして、イベントの数と親母集団の割合を表示します。さらにデータ分析するために、イベントの数とパーセンテージを記録します。ナイーブな無傷の心臓のダブレットを除去した後、CD45陽性細胞の約20%がCD19陽性B細胞になると予想されています。
これらの細胞のうち、平均して5.5%間質腔に位置しています。94.5%は血管内腔にあります。心臓に見られるB細胞集団全体のうち、表面マーカーCD11bに基づくB1細胞に対応するのは約1.6%のみであり、残りの98.4%はB2細胞に対応します。
フローサイトメトリーで心筋B細胞を分析する場合、プロトコルに従って心臓を適切に灌流およびミンチすることが重要です。消化された心臓の適切なろ過も、免疫細胞の回復を最大化するために不可欠です。
