我们的三维干细胞来源人心肌的体外模型提高了传统二维细胞培养的生物保真度，同时消除了与实验动物试验相关的种间差异。我们的多组织生物反应器设计带有稳定的后跟踪器，可最大限度地提高组织成功率，并提高工程心脏组织功能深入表征的准确性。由于心力衰竭仍然是全球死亡的主要原因，我们的工程心脏组织使研究人员能够对人类心脏病进行建模，并筛选潜在的治疗方法。
首先，在铸件支架中放置四个铝负母铸件，使柱孔与三角形搁板对面的死角对齐。将设备放在两个平行支架之间，并使用一块 0.5 毫米厚的矩形硅胶片作为垫圈将侧面夹在一起，以防止液体 PDMS 泄漏。在浅容器中，将 0.5 毫升 PDMS 固化剂与 5 毫升 PDMS 弹性体基以 1 比 10 的比例混合，并剧烈搅拌 5 分钟。
在强真空下在真空室中对PDMS混合物进行脱气，直到气泡消失。接下来，将PDMS混合物倒在浇注设备上，过量填充以确保完全覆盖每个槽。在PDMS机架的主体上添加小的彩色玻璃珠，与柱子相对，用于每个机架的唯一标识。
将水平调平的铸造设备放入强真空下真空室至少 12 小时。让 PDMS 在室温下远离灰尘固化 48 小时，以实现完全固化和最大强度的脆弱柱子。拆下夹子、支架和硅胶片从铸造设备上取下。
使用不锈钢剃须刀片，修剪掉铸造设备和框架支架顶部的 PDMS 薄膜。用手指将 PDMS 机架与铸件支架的侧面分开。将钝的不锈钢剃须刀片插入铸件和铸件支架之间的死角并将它们撬开，确保填充死角的 PDMS 保留在铸件支架上。
然后，使用锋利的不锈钢刀片，从柱子的尖端切掉剩余的PDMS薄膜和死角PDMS。用手指慢慢地将PDMS机架与柱子对面一侧的铸件分开。继续交替两侧，直到柱子没有主铸件。
如前所述，释放所有 PDMS 机架和立柱，并使用锋利的剃须刀片从机架上修剪掉任何剩余的多余 PDMS。使用热塑性熔融沉积建模 3D 打印机，打印稳定柱跟踪器或 SPoT 铸造设备的组件。确保 3D 打印件之间以及 PDMS 机架和三叉夹具之间牢固的压合。
还要确认PDMS机架与刚好到达孔底的柱子紧密贴合，而不会弯曲。将 0.5 毫升黑色 PDMS A 部分与 0.5 毫升 B 部分混合在小型称重船或浅容器中，直到溶液颜色均匀。在强真空下将混合的黑色PDMS在真空室中脱气20分钟。
将脱气后的黑色PDMS倒在3D打印底座上以填充孔并敲击以确保没有气泡残留。尽可能多地从底座上刮掉多余的PDMS。将三叉夹片卡在底座上，并将 PDMS 机架放入三叉夹具上的凹槽中，确保柱子的末端浸入圆形孔中的黑色 PDMS 中。
让黑色 PDMS 在室温下远离灰尘固化 48 小时。滑出三叉戟，最大限度地减少柱子上的张力。使用小镊子，刮掉每个SPoT周围的黑色PDMS薄膜，然后将细尖弯曲的镊子插入SPoT孔中，以将其从3D打印底座中释放出来。
检查SPoT，并使用细剪刀修剪铸造过程中剩余的任何黑色PDMS薄膜。通过将 PDMS 机架安装到 polys 手机框架上，然后将其滑到黑色底板上，确保完成的柱子长度正确。高压灭菌生物反应器并制备细胞混合物后，继续制备hECT。
戴上无菌手套，从装有生物反应器部件的高压灭菌袋中取出黑色底板，并将其放入 60 毫升培养皿中，孔朝上。将 44 微升细胞混合物缓慢移液到每个孔中，以避免引入气泡。戴上一副新的无菌手套，从高压灭菌袋中取出带有PDMS架的聚砜框架。
将框架降低到底板上，使框架的末端适合底板末端的凹槽。确保柱子都是直的并且框架没有倾斜，将生物反应器放入 60 毫米的培养皿中。在60毫升培养皿中加入一毫升心肌细胞维持培养基中的1毫升10%FBS，以增加hECT固化的湿度。
将无盖培养皿放入高调的 100 毫米培养皿中，并用 100 毫米培养皿盖住，然后将生物反应器放回 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中，让胶原蛋白与悬浮细胞形成凝胶。两小时后，将培养皿从培养箱中取出。在心肌细胞维持培养基中加入 13 毫升 10% FBS，倾斜培养皿以使培养基在 PTFE 底板和 PDMS 架之间流动。
从侧面检查生物反应器是否有气泡，然后将培养皿放回培养箱。如果空气被截留，将生物反应器从培养基中倾斜，让气泡破裂并再次缓慢降低，或者使用带有凝胶加载尖端的微量移液器在不干扰柱子的情况下虹吸空气。通过框架中的窗口检查 hECT 压实。
在 24 至 96 小时内，hECT 会压实并变得不透明。当 hECT 压实至少 30% 时，取下底板与原始直径相比。用心肌细胞维持培养基填充含有生物反应器的 60 毫米培养皿，直到液体与培养皿的边缘冲洗，然后向新的 14 毫米培养皿中加入 60 毫升。
戴上无菌手套时，将生物反应器翻转过来，使底板位于顶部。检查是否有滞留的气泡后，慢慢抬起底板，保持水平。确保帖子提示处于焦点位置。
打开阈值开关并调整滑块，直到 SPoT 被很好地划分，并且不会随着 hECT 收缩而改变形状。使用矩形工具在其中一个 SPoT 周围绘制一个矩形，然后单击帖子边界框内的设置按钮以设置 SPoT 周围的矩形位置，确保 SPoT 始终保持在矩形的边界内。对另一个帖子重复该过程，并将其记录在第二组下。
调整对象大小设置以防止程序跟踪较小的对象，并确保每个矩形中跟踪的对象数量保持不变。该界面实时显示被跟踪对象之间的测量距离。使用此图来监视噪声。
在起搏频率赫兹标头下，指示所需频率的范围以及从最小到最大步进所需的间隔。在右侧的框中，选择所需的设置时间以允许 hECT 调整到新的起搏频率，然后指定记录时间和起搏电压。通过单击“开始程序”按钮开始程序。
记录来自一个频率的数据后，将刺激器频率增加所需的间隔以进行新的记录，直到达到最大频率。此处显示了 hECT 的代表性图像，从底部查看，创建时没有 SPoT 和有 SPoT。SPoTs提供了一个定义的形状，以便在数据采集过程中进行跟踪。
在一些极端情况下，跟踪对象甚至被遮挡了。用于光学跟踪和降噪的更可靠的形状能够测量弱势组织，其产生的力低至一微牛顿。SPoTs提供了防止hECT损失的帽几何形状。
在当前起搏设置中，测得的 hECT 功能在加热阶段的当前起搏设置中在延长的培养时间内保持稳定。与生理温度下的测量结果相比，hECTs在室温下显示出改变的收缩动力学，收缩和松弛的速率较慢。在较高频率下，hECT在室温下往往较弱。
在较低频率下，hECT在室温下往往更强。当在36摄氏度的温度下起搏时，hECT具有更高的自发心跳率和更广阔的捕获频率范围。温度控制环境确保了测量的 hECT 功能的生理相关性。
此外，多组织生物反应器的共享培养基浴有助于研究不同细胞组成的 hECT 之间的旁分泌信号转导。将SPoT添加到我们的多组织生物反应器中，使研究人员能够有效地研究具有异常高或低张力的患病心肌，否则这些心肌会从无盖柱的末端滑落。
