Notre modèle in vitro de muscle cardiaque humain tridimensionnel dérivé de cellules souches améliore la biofidélité de la culture cellulaire bidimensionnelle traditionnelle tout en éliminant les différences interspécifiques associées aux tests sur les animaux en laboratoire. Notre conception de bioréacteur multi-tissus avec des post-trackers stables maximise le succès des tissus et améliore la précision de la caractérisation approfondie de la fonction des tissus cardiaques modifiés. Alors que l’insuffisance cardiaque continue d’être la principale cause de décès dans le monde, nos tissus cardiaques modifiés permettent aux chercheurs de modéliser les maladies cardiaques humaines, ainsi que de dépister des thérapies potentielles.
Pour commencer, positionnez quatre moulages principaux négatifs en aluminium dans le support de moulage de manière à ce que les trous de poteau s’alignent avec l’espace mort opposé aux étagères triangulaires. Placez l’appareil entre deux supports parallèles et serrez les côtés ensemble à l’aide d’une pièce rectangulaire de feuille de silicone de 0,5 millimètre d’épaisseur comme joint d’étanchéité pour éviter les fuites du liquide PDMS. Dans un récipient peu profond, mélanger 0,5 millilitre d’agent de durcissement PDMS avec cinq millilitres de base d’élastomère PDMS dans un rapport de un à 10 et remuer vigoureusement pendant cinq minutes.
Dégazer le mélange PDMS dans une chambre à vide sous vide poussé jusqu’à ce que les bulles disparaissent. Ensuite, versez le mélange PDMS sur l’appareil de coulée, en le remplissant pour assurer une couverture complète de chaque fente. Ajoutez de petites billes de verre colorées sur le corps des racks PDMS à l’opposé du côté avec les poteaux pour l’identification unique de chaque rack.
Placez l’appareil de coulée horizontalement dans la chambre à vide sous un vide puissant pendant au moins 12 heures. Laissez le PDMS durcir à température ambiante à l’abri de la poussière pendant 48 heures pour permettre un durcissement complet et une résistance maximale des tenons délicats. Retirez la pince, les supports et la feuille de silicone de l’appareil de coulée.
À l’aide d’une lame de rasoir en acier inoxydable, coupez le film PDMS sur le dessus de l’appareil de coulée et des supports de cadre. Utilisez les doigts pour séparer les racks PDMS des côtés du support de coulée. Insérez une lame de rasoir en acier inoxydable émoussée dans l’espace mort entre le moulage et le support de coulée et séparez-les, en veillant à ce que le PDMS remplissant l’espace mort reste avec le support de coulée.
Ensuite, à l’aide d’une lame tranchante en acier inoxydable, découpez les films PDMS restants et l’espace mort PDMS des extrémités des poteaux. À l’aide des doigts, séparez lentement le rack PDMS du plâtre du côté opposé aux poteaux. Continuez à alterner les côtés jusqu’à ce que les poteaux soient libérés des lancers principaux.
Libérez tous les racks PDMS et les poteaux comme indiqué précédemment, et utilisez une lame de rasoir tranchante pour couper tout excédent de PDMS restant des racks. À l’aide d’une imprimante 3D de modélisation par dépôt de fil fondu thermoplastique, imprimez les composants de l’appareil de coulée de poteau stable, ou SPoT. Assurez-vous d’un ajustement sûr de la presse entre les pièces imprimées en 3D et entre les racks PDMS et le gabarit à trois branches.
Assurez-vous également que les racks PDMS s’adaptent parfaitement aux poteaux qui atteignent le fond des puits sans être pliés. Mélangez 0,5 millilitre de PDMS noir partie A à 0,5 millilitre de partie B dans un petit bateau de pesée ou un récipient peu profond jusqu’à ce que la solution soit de couleur uniforme. Dégazer le PDMS noir mélangé dans une chambre à vide sous vide puissant pendant 20 minutes.
Versez le PDMS noir dégazé sur la base imprimée en 3D pour remplir les trous et tapotez pour vous assurer qu’il ne reste pas de bulles. Grattez autant que possible l’excédent de PDMS de la base. Enclenchez la pièce à trois dents sur la base et placez les racks PDMS dans les rainures du gabarit à trois branches, en veillant à ce que les extrémités des poteaux plongent dans le PDMS noir dans les puits circulaires.
Laissez le PDMS noir durcir à température ambiante à l’abri de la poussière pendant 48 heures. Faites glisser la pièce à trois branches, en minimisant la tension sur les poteaux. À l’aide d’une petite pince, grattez le mince film noir PDMS entourant chaque SPoT, puis insérez des pinces à pointe fine et courbées dans le puits SPoT pour le libérer de la base imprimée en 3D.
Inspectez les SPoT et coupez tout film PDMS noir restant du processus de coulée à l’aide de ciseaux à vannas fins. Assurez-vous que les poteaux finis sont de la bonne longueur en installant les racks PDMS sur le cadre du téléphone portable en polys, puis en le faisant glisser sur la plaque de base noire. Après l’autoclavage du bioréacteur et la préparation du mélange cellulaire, procédez à la fabrication des hECTs.
En portant des gants stériles, retirez la plaque de base noire du sac autoclavé contenant les pièces du bioréacteur et placez-la dans une boîte de 60 millilitres avec les puits vers le haut. Pipetez lentement 44 microlitres du mélange cellulaire dans chaque puits pour éviter d’introduire des bulles. Munis d’une nouvelle paire de gants stériles, retirez le cadre en polysulfone avec les racks PDMS du sac de l’autoclave.
Abaissez le cadre sur la plaque de base de manière à ce que les extrémités du cadre s’insèrent dans les rainures à l’extrémité de la plaque de base. En veillant à ce que les poteaux soient tous droits et que le châssis ne soit pas incliné, placez le bioréacteur dans une boîte de 60 millimètres. Ajouter un millilitre de FBS à 10 % dans un milieu d’entretien des cardiomyocytes dans le plat de 60 millilitres pour augmenter l’humidité au fur et à mesure que les hECT se solidifient.
Placez le plat sans couvercle dans un plat à profil haut de 100 millimètres et couvrez-le d’un couvercle de plat de 100 millimètres, puis remettez le bioréacteur dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour permettre au collagène de former un gel avec les cellules en suspension. Au bout de deux heures, retirez le plat de l’incubateur. Ajouter 13 millilitres de FBS à 10 % dans le milieu d’entretien des cardiomyocytes, en inclinant la parabole pour permettre au fluide de s’écouler entre la plaque de base en PTFE et les grilles PDMS.
Inspectez le bioréacteur par le côté pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air et remettez la boîte dans l’incubateur. Si de l’air est emprisonné, inclinez le bioréacteur hors du milieu pour laisser la bulle se briser et abaissez-le lentement à nouveau, ou utilisez une micro-pipette avec un embout de chargement de gel pour siphonner l’air sans perturber les poteaux. Inspectez le compactage hECT à travers la fenêtre du cadre.
En 24 à 96 heures, les hECTs se compactent et deviennent plus opaques. Retirez la plaque de base lorsque les hECT sont compactés d’au moins 30 % par rapport au diamètre d’origine. Remplissez la boîte de 60 millimètres contenant le bioréacteur avec du milieu d’entretien des cardiomyocytes jusqu’à ce que le liquide s’écoule avec le rebord de la boîte et ajoutez 14 millilitres à une nouvelle boîte de 60 millimètres.
Tout en portant des gants stériles, retournez le bioréacteur dans sa boîte de manière à ce que la plaque de base soit sur le dessus. Après avoir inspecté les bulles d’air emprisonnées, soulevez lentement la plaque de base en la maintenant à niveau. Assurez-vous que les conseils de publication sont nets.
Allumez le commutateur de seuillage et ajustez le curseur jusqu’à ce que les SPoT soient bien délimités et ne changent pas de forme lorsque l’hECT se contracte. Utilisez l’outil rectangle pour dessiner un rectangle autour de l’un des SPoT, puis cliquez sur le bouton Définir un à l’intérieur de la zone de limites du poteau pour définir la position du rectangle autour du SPoT, en veillant à ce que le SPoT reste toujours dans les limites du rectangle. Répétez le processus sur l’autre poste et enregistrez-le sous l’ensemble deux.
Ajustez les paramètres de taille de l’objet pour empêcher le programme de suivre des objets plus petits et assurez-vous que le nombre d’objets suivis dans chaque rectangle reste constant. L’interface affiche en temps réel la distance mesurée entre les objets suivis. Utilisez ce graphique pour surveiller le bruit.
Sous l’en-tête hertz de fréquence de stimulation, indiquez la plage de fréquences souhaitées et l’intervalle souhaité pour passer de min à max. Dans les cases de droite, choisissez la durée de réglage souhaitée pour permettre à l’hECT de s’adapter à la nouvelle fréquence de stimulation, puis spécifiez la durée d’enregistrement et la tension de stimulation. Commencez le programme en cliquant sur le bouton Démarrer le programme.
Une fois que les données d’une fréquence ont été enregistrées, augmentez la fréquence du stimulateur de l’intervalle souhaité pour un nouvel enregistrement jusqu’à ce que la fréquence maximale soit atteinte. Des images représentatives des hECT sont présentées ici telles qu’elles sont vues du bas, créées sans SPoT et avec des SPoT. Les SPoT ont fourni une forme unique définie à suivre pendant l’acquisition des données.
Dans certains cas extrêmes, l’objet de suivi était même masqué. Une forme plus fiable pour le suivi optique et la réduction du bruit a permis de mesurer des tissus fragiles avec une force développée aussi faible qu’un micro Newton. Les SPoT ont fourni une géométrie de capuchon qui a empêché la perte d’hECT.
La fonction hECT mesurée était stable sur une période de culture prolongée dans la configuration de stimulation actuelle avec la platine chauffée. Par rapport aux mesures à température physiologique, les hECT ont montré une dynamique de contraction modifiée à température ambiante, avec des taux de contraction et de relaxation plus lents. À des fréquences plus élevées, les hECTs avaient tendance à être plus faibles à température ambiante.
À des fréquences plus basses, les hECT avaient tendance à être plus forts à température ambiante. Lorsqu’ils étaient rythmés à 36 degrés Celsius, les hECT avaient un rythme de battement spontané plus élevé et une gamme plus étendue de fréquences de capture. L’environnement à température contrôlée garantit la pertinence physiologique de la fonction des hECTs mesurées.
De plus, le bain de milieux partagé du bioréacteur multi-tissus facilite l’étude de la signalisation paracrine entre des hECT de compositions cellulaires différentes. L’ajout de SPoT à notre bioréacteur multi-tissus permet aux chercheurs d’étudier efficacement les myocardes malades avec une tension anormalement élevée ou faible, qui autrement glisserait des extrémités des tenons non bouchés.
