3차원 줄기세포 유래 인간 심장 근육의 체외 모델은 실험실 동물 실험과 관련된 종간 차이를 제거하면서 기존 2차원 세포 배양의 생체 충실도를 향상시킵니다. 안정적인 포스트 트래커를 갖춘 당사의 다중 조직 바이오리액터 설계는 조직 성공을 극대화하고 엔지니어링된 심장 조직 기능의 심층 특성 분석의 정확도를 향상시킵니다. 심부전이 전 세계적으로 여전히 주요 사망 원인이 됨에 따라, 당사의 엔지니어링 심장 조직을 통해 연구원들은 인간의 심장 질환을 모델링하고 잠재적인 치료법을 선별할 수 있습니다.
시작하려면 기둥 구멍이 삼각형 선반 반대쪽의 데드 스페이스와 정렬되도록 주조 홀더에 4개의 알루미늄 네거티브 마스터 캐스트를 배치합니다. 두 개의 평행 브래킷 사이에 장치를 놓고 clamp액체 PDMS의 누출을 방지하기 위해 0.5mm 두께의 실리콘 시트의 직사각형 조각을 개스킷으로 사용하여 측면을 함께 고정합니다. 얕은 용기에 PDMS 경화제 0.5mL와 PDMS 엘라스토머 염기 5mL를 1:10 비율로 혼합하고 5분 동안 세게 저어줍니다.
기포가 사라질 때까지 강한 진공 상태에서 진공 챔버에서 PDMS 혼합물을 탈기합니다. 다음으로, PDMS 혼합물을 주조 장치에 붓고 각 슬롯이 완전히 덮이도록 과도하게 채웁니다. 각 랙의 고유한 식별을 위해 포스트가 있는 측면 반대쪽에 PDMS 랙의 본체에 작은 컬러 유리 구슬을 추가합니다.
수평으로 수평을 이루는 주조 장치를 최소 12시간 동안 강한 진공 상태에서 진공 챔버에 놓습니다. PDMS를 먼지가 없는 실온에서 48시간 동안 경화시켜 섬세한 포스트를 완전히 경화하고 강도를 극대화할 수 있습니다. cl 제거amp, 브래킷 및 실리콘 시트를 주조 장치에서 제거합니다.
스테인리스 스틸 면도날을 사용하여 주조 장치 및 프레임 지지대 상단의 PDMS 필름을 잘라냅니다. 손가락을 사용하여 캐스트 홀더의 측면에서 PDMS 랙을 분리합니다. 무딘 스테인리스강 면도날을 주물과 주조 홀더 사이의 데드 스페이스에 삽입하고 들어 올려 데드 스페이스를 채우는 PDMS가 캐스트 홀더와 함께 유지되도록 합니다.
그런 다음 날카로운 스테인리스 스틸 칼날을 사용하여 기둥 끝에서 남아 있는 PDMS 필름과 데드 스페이스 PDMS를 잘라냅니다. 손가락을 사용하여 포스트 반대쪽의 캐스트에서 PDMS 랙을 천천히 분리합니다. 기둥에 마스터 캐스트가 없어질 때까지 계속해서 측면을 번갈아 가며 사용합니다.
앞에서 설명한 대로 모든 PDMS 랙과 포스트를 비우고 날카로운 면도날을 사용하여 랙에 남아 있는 여분의 PDMS를 잘라냅니다. 열가소성 용융 증착 모델링 3D 프린터를 사용하여 안정적인 포스트 트래커(SPoT) 주조 장치의 구성 요소를 인쇄합니다. 3D 프린팅된 조각 사이와 PDMS 랙과 세 갈래 지그 사이에 단단히 압입되도록 합니다.
또한 PDMS 랙이 구부러지지 않고 웰 바닥에 닿는 기둥에 꼭 맞는지 확인합니다. 0.5 밀리리터의 검은색 PDMS 파트 A와 0.5 밀리리터의 파트 B를 작은 계량 보트 또는 얕은 용기에 용액의 색상이 균일해질 때까지 혼합합니다. 혼합된 검은색 PDMS를 강한 진공 상태에서 진공 챔버에서 20분 동안 탈기합니다.
가스가 제거된 검은색 PDMS를 3D 프린팅 베이스에 부어 구멍을 채우고 두드려 기포가 남지 않도록 합니다. 베이스에서 여분의 PDMS를 최대한 많이 긁어냅니다. 세 갈래 조각을 베이스에 끼우고 PDMS 랙을 세 갈래 지그의 홈에 배치하여 포스트의 끝이 원형 웰의 검은색 PDMS에 담그도록 합니다.
검은색 PDMS를 먼지가 없는 실온에서 48시간 동안 경화시킵니다. 기둥의 장력을 최소화하면서 세 갈래 조각을 밀어냅니다. 작은 집게를 사용하여 각 SPoT를 둘러싼 얇은 검은색 PDMS 필름을 긁어낸 다음 끝이 가늘고 구부러진 집게를 SPoT 웰에 삽입하여 3D 프린팅 베이스에서 분리합니다.
SPoT를 검사하고 미세한 vannas 가위를 사용하여 주조 공정에서 남아 있는 검은색 PDMS 필름을 트리밍합니다. PDMS 랙을 폴리 휴대폰 프레임에 장착한 다음 검은색 베이스 플레이트에 밀어 넣어 완성된 기둥의 길이가 올바른지 확인합니다. 바이오리액터를 고압멸균하고 셀 혼합물을 준비한 후 hECT 제조를 진행합니다.
멸균 장갑을 착용하고 생물반응기 부품이 들어 있는 오토클레이브 백에서 검은색 베이스 플레이트를 제거하고 웰이 위를 향하도록 하여 60밀리리터 접시에 넣습니다. 기포가 생기지 않도록 세포 혼합물 44마이크로리터를 각 웰에 천천히 피펫팅합니다. 새 멸균 장갑을 착용하고 오토클레이브 백에서 PDMS 랙이 있는 폴리설폰 프레임을 제거합니다.
프레임의 끝이 베이스 플레이트 끝의 홈에 맞도록 프레임을 베이스 플레이트 위로 내립니다. 기둥이 모두 직선이고 프레임이 기울어지지 않았는지 확인하고 생물 반응기를 60mm 접시에 놓습니다. 심근세포 유지 배지에 10%FBS 1밀리리터를 60밀리리터 접시에 첨가하여 hECT가 응고됨에 따라 습도를 높입니다.
뚜껑이 없는 접시를 100mm 접시에 넣고 100mm 접시 뚜껑으로 덮은 다음 생물 반응기를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터로 되돌려 콜라겐이 현탁액에 있는 세포와 함께 젤을 형성할 수 있도록 합니다. 2시간 후 인큐베이터에서 접시를 꺼냅니다. 심근세포 유지 배지에 13밀리리터의 10% FBS를 추가하고 배지가 PTFE 베이스 플레이트와 PDMS 랙 사이를 흐르도록 접시를 기울입니다.
측면에서 바이오리액터에 기포가 없는지 검사하고 접시를 인큐베이터로 되돌립니다. 공기가 갇힌 경우 바이오리액터를 배지 밖으로 기울여 기포가 끊어지도록 하고 천천히 다시 내리거나 젤 로딩 팁이 있는 마이크로 피펫을 사용하여 포스트를 방해하지 않고 공기를 빨아들입니다. 프레임의 창을 통해 hECT 압축을 검사합니다.
24시간에서 96시간 동안 hECT는 압축되고 불투명해집니다. hECT가 원래 직경에 비해 30% 이상 압축되면 베이스 플레이트를 제거합니다. 액체가 접시 가장자리와 함께 플러시될 때까지 생물 반응기가 들어 있는 60mm 접시에 심근세포 유지 배지를 채우고 새 14mm 접시에 60ml를 추가합니다.
멸균 장갑을 낀 상태에서 접시에서 생물반응기를 뒤집어 베이스 플레이트가 위에 오도록 합니다. 갇힌 기포가 있는지 검사한 후 수평을 유지하면서 베이스 플레이트를 천천히 들어 올립니다. 게시물 팁에 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다.
임계값 스위치를 켜고 SPoT가 명확하게 구분되고 hECT가 수축할 때 모양이 변경되지 않을 때까지 슬라이더를 조정합니다. 사각형 도구를 사용하여 SPoT 중 하나 주위에 사각형을 그리고 포스트 경계 상자 안에 있는 하나 설정 버튼을 클릭하여 SPoT 주위의 사각형 위치를 설정하여 SPoT가 항상 사각형 경계 내에 유지되도록 합니다. 이 과정을 다른 포스트에 반복하고 세트 2에 기록합니다.
프로그램이 더 작은 개체를 추적하지 않도록 개체 크기 설정을 조정하고 각 사각형에서 추적되는 개체 수가 일정하게 유지되도록 합니다. 인터페이스는 추적된 물체 사이의 측정된 거리를 실시간으로 보여줍니다. 이 그래프를 사용하여 노이즈를 모니터링합니다.
페이싱 주파수 헤르츠 헤더 아래에서 원하는 주파수의 범위와 최소에서 최대로 단계별로 이동하기 위한 원하는 간격을 나타냅니다. 오른쪽 상자에서 hECT가 새 페이싱 주파수에 맞게 조정할 수 있도록 원하는 설정 시간을 선택한 다음 녹음 시간과 페이싱 볼륨을 지정합니다.tage. 프로그램 시작 버튼을 클릭하여 프로그램을 시작합니다.
한 주파수의 데이터가 기록된 후 최대 주파수에 도달할 때까지 새 녹음을 위해 원하는 간격만큼 자극기 주파수를 높입니다. hECT의 대표 이미지는 SPoT 없이 SPoT를 사용하여 생성된 하단에서 본 것과 같습니다. SPoT는 데이터 수집 중에 추적할 수 있는 단일 정의된 형상을 제공했습니다.
일부 극단적인 경우에는 추적 물체가 가려지기도 했습니다. 광학 추적 및 노이즈 감소를 위한 보다 신뢰할 수 있는 형태는 1마이크로뉴턴의 낮은 현상된 힘으로 약한 조직을 측정할 수 있게 했습니다. SPoT는 hECT 손실을 방지하는 캡 형상을 제공했습니다.
측정된 hECT 기능은 가열된 스테이지가 있는 전류 페이싱 설정에서 확장된 배양 시간 동안 안정적이었습니다. 생리적 온도에서의 측정과 비교했을 때, hECT는 실온에서 수축 및 이완 속도가 느려진 수축 역학이 변경되었음을 보여주었습니다. 더 높은 주파수에서 hECT는 실온에서 더 약한 경향이 있었습니다.
낮은 주파수에서 hECT는 실온에서 더 강한 경향이 있었습니다. 섭씨 36도에서 페이스를 조절할 때 hECT는 더 높은 자발적 박동률과 더 넓은 범위의 캡처 주파수를 가졌습니다. 온도 제어 환경은 측정된 hECT 기능의 생리학적 관련성을 보장합니다.
또한 다중 조직 생물반응기의 공유 배지 배스는 서로 다른 세포 조성의 hECT 간 파라크린 신호 연구를 용이하게 합니다. 다조직 바이오리액터에 SPoT를 추가하면 연구원들이 비정상적으로 높거나 낮은 장력을 가진 병든 심근을 효율적으로 연구할 수 있으며, 그렇지 않으면 뚜껑이 없는 포스트의 끝에서 미끄러질 수 있습니다.
