当社の3次元幹細胞由来ヒト心筋のinvitroモデルは、従来の2次元細胞培養の生体忠実度を向上させると同時に、実験動物実験に関連する種間の違いを排除します。安定したポストトラッカーを備えた当社のマルチティッシュバイオリアクター設計は、組織の成功を最大化し、操作された心臓組織機能の詳細な特性評価の精度を向上させます。心不全が世界の死因の第1位であり続ける中、当社の人工心臓組織により、研究者はヒトの心臓疾患をモデル化し、潜在的な治療法をスクリーニングすることができます。
まず、4つのアルミニウムネガティブマスターキャストをキャストホルダーに配置して、支柱の穴が三角形の棚の反対側のデッドスペースに揃うようにします。装置を2つの平行ブラケットの間に置き、厚さ0.5mmのシリコーンシートの長方形の部分をガスケットとして使用して側面をクランプし、液体PDMSの漏れを防ぎます。浅い容器に、0.5ミリリットルのPDMS硬化剤と5ミリリットルのPDMSエラストマーベースを1対10の比率で混合し、5分間激しく攪拌します。
PDMS混合物を真空チャンバー内で、気泡が消えるまで強力真空下で脱気します。次に、PDMS混合物を鋳造装置に注ぎ、各スロットを完全に覆うように過剰に充填します。PDMSラックの本体の支柱と反対側に小さな色ガラスビーズを追加して、各ラックを一意に識別できるようにします。
水平に水平にした鋳造装置を、少なくとも12時間、強力な真空下で真空チャンバー内に置きます。PDMSを埃から離れた室温で48時間硬化させ、デリケートなポストを完全に硬化させ、強度を最大限に高めます。クランプ、ブラケット、シリコンシートを鋳造装置から取り外します。
ステンレス鋼のかみそりの刃を使用して、鋳造装置とフレームサポートの上部にあるPDMSフィルムを切り取ります。指を使って、PDMS ラックをキャスト・ホルダーの側面から切り離します。鈍いステンレス鋼のかみそりの刃をキャストとキャストホルダーの間のデッドスペースに挿入し、それらをこじ開けて、デッドスペースを埋めるPDMSがキャストホルダーに残るようにします。
次に、鋭利なステンレス鋼の刃を使用して、残りのPDMSフィルムとデッドスペースPDMSをポストの先端から切り取ります。指を使って、支柱の反対側のキャストから PDMS ラックをゆっくりと離します。支柱からマスターキャストがなくなるまで、左右を交互に進めます。
前述したように、すべての PDMS ラックと支柱を解放し、鋭利なカミソリの刃を使用して、ラックから余分な PDMS を切り取ります。熱可塑性溶融堆積モデリング3Dプリンターを使用して、安定ポストトラッカー(SPoT)鋳造装置のコンポーネントをプリントします。3Dプリントされた部品の間、およびPDMSラックと三又治具の間にしっかりと圧入されるようにします。
また、PDMSラックが、ウェルの底に届くだけの支柱に、曲がらずにぴったりと収まっていることを確認します。0.5ミリリットルの黒色PDMSパートAと0.5ミリリットルのパートBを小型計量ボートまたは浅い容器で、溶液の色が均一になるまで混合します。混合した黒色PDMSを真空チャンバー内で強真空下で20分間脱気する。
脱気した黒いPDMSを3Dプリントされたベースに流し込み、穴を埋め、泡が残らないようにします。ベースから余分なPDMSをできるだけ多くこすり落とします。三股の部品をベースにカチッとはめ込み、PDMS ラックを三股のジグの溝に置き、支柱の端が円形ウェルの黒い PDMS に浸るようにします。
黒色のPDMSを室温で48時間硬化させ、ほこりから離します。三又をスライドさせて、支柱の張力を最小限に抑えます。小さな鉗子を使用して、各SPoTを囲む薄い黒いPDMSフィルムをこすり落とし、先端が細かく曲がった鉗子をSPoTウェルに挿入して、3Dプリントされたベースから解放します。
SPoTを検査し、鋳造プロセスから残った黒いPDMSフィルムを細いバンナハサミでトリミングします。PDMS ラックを polys 携帯電話フレームに取り付け、これを黒のベース プレートにスライドさせて、完成した支柱が正しい長さであることを確認します。バイオリアクターをオートクレーブし、細胞混合物を調製した後、hECTの作製に進みます。
滅菌手袋を着用し、バイオリアクターの部品が入ったオートクレーブバッグから黒いベースプレートを取り出し、ウェルを上に向けて60ミリリットルの皿に入れます。44マイクロリットルの細胞混合物を各ウェルにゆっくりとピペットで移し、気泡が入らないようにします。新しい滅菌手袋を着用し、ポリスルホンフレームとPDMSラックをオートクレーブバッグから取り外します。
フレームの端がベースプレートの端の溝に収まるように、フレームをベースプレートに下ろします。支柱がすべてまっすぐで、フレームが傾いていないことを確認して、バイオリアクターを60ミリメートルの皿に入れます。心筋細胞維持培地に1ミリリットルの10%FBSを60ミリリットルのディッシュに加え、hECTが固化するにつれて湿度を上げます。
蓋のない皿を目立つ100mmの皿に入れ、100mmの皿の蓋で覆い、バイオリアクターを摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーターに戻して、コラーゲンが懸濁液中の細胞とゲルを形成できるようにします。2時間後、インキュベーターから皿を取り出します。心筋細胞維持培地に13ミリリットルの10%FBSを加え、皿を傾けて培地がPTFEベースプレートとPDMSラックの間を流れるようにします。
バイオリアクターを側面から点検し、気泡がないことを確認し、ディッシュをインキュベーターに戻します。空気が閉じ込められている場合は、バイオリアクターを培地から傾けて気泡を破砕し、ゆっくりと再び下げるか、ゲルローディングチップ付きのマイクロピペットを使用して、支柱を乱さずに空気を吸い上げます。フレーム内の窓からhECT圧縮を検査します。
24時間から96時間かけて、hECTは圧縮され、不透明になります。hECTが元の直径と比較して少なくとも30%圧縮されたら、ベースプレートを取り外します。バイオリアクターを含む60ミリメートルのディッシュに心筋細胞維持培地を充填し、液体がディッシュの縁で洗い流されるまで充填し、新しい60ミリメートルのディッシュに14ミリリットルを加えます。
滅菌手袋を着用した状態で、ベースプレートが上になるように、バイオリアクターを皿の中で裏返します。気泡が閉じ込められていないか検査した後、ベースプレートを水平に保ちながらゆっくりと持ち上げます。投稿のヒントにフォーカスが合っていることを確認します。
しきい値スイッチをオンにし、SPoTが適切に区切られ、hECTが収縮しても形状が変化しなくなるまでスライダーを調整します。長方形ツールを使用して SPoT の 1 つの周囲に長方形を描画し、投稿の境界ボックス内の [1 つ設定] ボタンをクリックして SPoT の周囲に長方形の位置を設定し、SPoT が常に長方形の境界内に収まるようにします。このプロセスを他の投稿に繰り返し、セット2に記録します。
オブジェクトのサイズ設定を調整して、プログラムが小さなオブジェクトを追跡しないようにし、各四角形で追跡されるオブジェクトの数が一定になるようにします。インターフェースには、追跡対象物間の測定距離がリアルタイムで表示されます。このグラフを使用して、ノイズを監視します。
ペーシング周波数ヘルツヘッダーの下に、必要な周波数の範囲と、最小から最大へのステップの間隔を示します。右側のボックスで、hECTが新しいペーシング周波数に調整できるように希望の設定時間を選択し、録音時間とペーシング電圧を指定します。プログラムの開始ボタンをクリックしてプログラムを開始します。
1つの周波数からのデータを記録した後、最大周波数に達するまで、新しい記録に必要な間隔だけ刺激装置の周波数を増やします。ここでは、SPoTなしとSPoTありで作成したhECTの代表的な画像を下から見たものです。SPoTは、データ取得中に追跡するための単一の定義された形状を提供しました。
極端な例では、追跡オブジェクトが不明瞭になることさえありました。光学トラッキングとノイズリダクションのためのより信頼性の高い形状により、1マイクロニュートンという低い発生力で弱い組織の測定が可能になりました。SPoTは、hECTの損失を防ぐキャップ形状を提供しました。
測定されたhECT機能は、加熱ステージを使用した現在のペーシングセットアップで、長時間の培養時間にわたって安定していました。生理学的温度での測定と比較して、hECTは室温で収縮ダイナミクスの変化を示し、収縮と弛緩の速度が遅くなりました。より高い周波数では、hECTは室温で弱くなる傾向がありました。
より低い周波数では、hECTは室温で強くなる傾向がありました。摂氏36度でペーシングすると、hECTは自発的なビートレートが高く、捕捉周波数の範囲が広がりました。温度管理された環境により、測定されたhECT機能の生理学的関連性が保証されます。
さらに、マルチティッシュバイオリアクターの共有培地槽は、異なる細胞組成のhECT間のパラクリンシグナル伝達の研究を容易にします。当社のマルチ組織バイオリアクターにSPoTを追加することで、研究者は、キャップのない支柱の端から滑り落ちるような、異常に高いまたは低い張力を持つ病気の心筋を効率的に研究することができます。
