Nosso modelo invitro de células-tronco tridimensionais derivadas do músculo cardíaco humano melhora a biofidelidade da cultura tradicional de células bidimensionais, ao mesmo tempo em que elimina as diferenças interespécies associadas aos testes em animais de laboratório. Nosso projeto de biorreator multitecidual com pós-rastreadores estáveis maximiza o sucesso do tecido e melhora a precisão da caracterização aprofundada da função do tecido cardíaco projetado. Como a insuficiência cardíaca continua a ser a principal causa de morte em todo o mundo, nossos tecidos cardíacos projetados permitem que os pesquisadores modelem doenças cardíacas humanas, bem como rastreiem potenciais terapias.
Para começar, posicione quatro moldes mestres negativos de alumínio no suporte do molde de modo que os orifícios do poste se alinhem com o espaço morto oposto às prateleiras do triângulo. Coloque o aparelho entre dois braquetes paralelos e prenda as laterais juntas usando uma peça retangular de chapa de silicone de 0,5 milímetro de espessura como uma junta para evitar o vazamento do PDMS líquido. Em um recipiente raso, misture 0,5 mililitros de agente de cura PDMS com cinco mililitros de base de elastômero PDMS em uma proporção de um para 10 e mexa vigorosamente por cinco minutos.
Desgaseifique a mistura de PDMS em uma câmara de vácuo sob um vácuo forte até que as bolhas desapareçam. Em seguida, despeje a mistura de PDMS sobre o aparelho de fundição, enchendo demais para garantir a cobertura completa de cada slot. Adicione pequenas contas de vidro colorido ao corpo dos racks PDMS opostos ao lado com os postes para a identificação única de cada rack.
Coloque o aparelho de fundição nivelado horizontalmente na câmara de vácuo sob um vácuo forte por pelo menos 12 horas. Deixe o PDMS curar à temperatura ambiente longe da poeira por 48 horas para permitir a cura completa e a máxima resistência dos pinos delicados. Remova a braçadeira, os suportes e as chapas de silicone do aparelho de fundição.
Usando uma lâmina de barbear de aço inoxidável, corte a película PDMS na parte superior do aparelho de fundição e dos suportes do quadro. Use os dedos para separar os racks PDMS das laterais do suporte fundido. Insira uma lâmina de barbear de aço inoxidável embotada no espaço morto entre o molde e o suporte fundido e separe-os, garantindo que o PDMS que preenche o espaço morto permaneça com o suporte fundido.
Em seguida, usando uma lâmina afiada de aço inoxidável, corte os filmes PDMS restantes e o PDMS de espaço morto das pontas dos postes. Usando os dedos, separe lentamente o rack PDMS do molde no lado oposto aos postes. Continue para os lados alternados até que os postos estejam livres dos elencos mestres.
Liberte todos os racks PDMS e os postes, como demonstrado anteriormente, e use uma lâmina de barbear afiada para aparar qualquer excesso de PDMS restante dos racks. Usando uma impressora 3D termoplástica de modelagem de deposição fundida, imprima os componentes do aparelho de fundição estável pós-rastreador, ou SPoT. Garanta um encaixe de prensa seguro entre as peças impressas em 3D e entre os racks PDMS e o gabarito de três pontas.
Confirme também se os racks PDMS se encaixam perfeitamente com os postes apenas atingindo o fundo dos poços sem serem dobrados. Misture 0,5 mililitros de PDMS preto parte A a 0,5 mililitros de parte B em um barco de pesagem pequeno ou em um recipiente raso até que a solução esteja de cor uniforme. Desgaseifique o PDMS preto misto em uma câmara de vácuo sob um vácuo forte por 20 minutos.
Despeje o PDMS preto desgaseificado na base impressa em 3D para preencher os orifícios e toque para garantir que não restem bolhas. Raspe o máximo possível de PDMS em excesso da base. Encaixe a peça de três pontas na base e coloque os racks PDMS nos sulcos do gabarito de três pontas, garantindo que as extremidades dos postes mergulhem no PDMS preto nos poços circulares.
Deixe o PDMS preto curar à temperatura ambiente longe da poeira por 48 horas. Deslize a peça de três pontas, minimizando a tensão nos postes. Usando pinças pequenas, raspe a fina película PDMS preta ao redor de cada SPoT e, em seguida, insira pinças finas e dobradas no poço SPoT para liberá-lo da base impressa em 3D.
Inspecione os SPoTs e corte qualquer filme PDMS preto restante do processo de fundição usando uma tesoura fina de vannas. Certifique-se de que os postes acabados tenham o comprimento correto, encaixando os racks PDMS na estrutura do telefone celular polis e, em seguida, deslizando-os para a placa de base preta. Após a autoclavação do biorreator e o preparo da mistura celular, proceder à fabricação dos hECTs.
Usando luvas estéreis, retire a placa de base preta do saco autoclavado contendo as partes do biorreator e coloque-a em um prato de 60 mililitros com os poços voltados para cima. Pipetar 44 microlitros da mistura celular em cada poço lentamente para evitar a introdução de bolhas. Usando um novo par de luvas estéreis, remova a estrutura de polissulfona com os racks PDMS do saco de autoclave.
Abaixe o quadro sobre a placa de base de modo que as extremidades do quadro se encaixem nos sulcos na extremidade da placa de base. Garantindo que os postes estejam todos retos e a estrutura não seja inclinada, coloque o biorreator em um prato de 60 milímetros. Adicione um mililitro de 10%FBS em meio de manutenção de cardiomiócitos ao prato de 60 mililitros para aumentar a umidade à medida que os hECTs se solidificam.
Coloque o prato sem tampa em um prato de alto perfil de 100 milímetros e cubra-o com uma tampa de prato de 100 milímetros, em seguida, devolva o biorreator a uma incubadora de dióxido de carbono de 37 graus Celsius a 5% para permitir que o colágeno forme um gel com as células em suspensão. Após duas horas, retire o prato da incubadora. Adicione 13 mililitros de FBS a 10% no meio de manutenção do cardiomiócito, inclinando a placa para permitir que o meio flua entre a placa de base de PTFE e os racks PDMS.
Inspecione o biorreator do lado para não haver bolhas de ar e devolva a placa para a incubadora. Se o ar estiver preso, incline o biorreator para fora do meio para deixar a bolha quebrar e baixá-la lentamente novamente, ou use uma micropipeta com uma ponta de carregamento de gel para sifão o ar sem perturbar os postes. Inspecione a compactação hECT através da janela na moldura.
Ao longo de 24 a 96 horas, os hECTs compactam e tornam-se opacos. Remova a placa de base quando os hECTs estiverem compactados em pelo menos 30% em relação ao diâmetro original. Encha a placa de 60 milímetros que contém o biorreator com meio de manutenção de cardiomiócitos até que o líquido lave com o lábio da placa e adicione 14 mililitros a uma nova placa de 60 milímetros.
Enquanto estiver usando luvas estéreis, vire o biorreator em seu prato para que a placa de base fique por cima. Depois de inspecionar se há bolhas de ar presas, levante lentamente a placa de base, mantendo-a nivelada. Certifique-se de que as dicas de postagem estejam em foco.
Ligue o interruptor de limite e ajuste o controle deslizante até que os SPoTs estejam bem demarcados e não mudem de forma à medida que o hECT se contrai. Use a ferramenta retângulo para desenhar um retângulo ao redor de um dos SPoTs e clique no botão definir um dentro da caixa de limites de postagem para definir a posição do retângulo ao redor do SPoT, garantindo que o SPoT permaneça sempre dentro do limite do retângulo. Repita o processo para a outra postagem e registre-o no conjunto dois.
Ajuste as configurações de tamanho do objeto para impedir que o programa rastreie objetos menores e certifique-se de que o número de objetos rastreados em cada retângulo permaneça constante. A interface mostra a distância medida entre os objetos rastreados em tempo real. Use este gráfico para monitorar o ruído.
Sob o cabeçalho hertz de frequência de marcação, indique a faixa de frequências desejadas e o intervalo desejado para passar de min a max. Nas caixas à direita, escolha o tempo de ajuste desejado para permitir que o hECT se ajuste à nova frequência de ritmo e, em seguida, especifique o tempo de gravação e a tensão de ritmo. Comece o programa clicando no botão Iniciar programa.
Após o registro dos dados de uma frequência, aumente a frequência do estimulador pelo intervalo desejado para uma nova gravação até que a frequência máxima tenha sido atingida. Imagens representativas de hECTs são mostradas aqui como vistas de baixo, criadas sem SPoTs e com SPoTs. Os SPoTs forneceram uma única forma definida para controlar durante a aquisição de dados.
Em alguns casos extremos, o objeto de rastreamento foi até obscurecido. Uma forma mais confiável para rastreamento óptico e redução de ruído permitiu a medição de tecidos fracos com uma força desenvolvida tão baixa quanto um micro Newton. Os SPoTs forneceram uma geometria da tampa que evitou a perda de hECT.
A função hECT medida foi estável ao longo do tempo de cultura prolongado na configuração de estimulação atual com o estágio aquecido. Comparadas às medidas em temperatura fisiológica, as hECTs apresentaram dinâmica de contração alterada à temperatura ambiente, com taxas mais lentas de contração e relaxamento. Em frequências mais altas, as hECTs tenderam a ser mais fracas à temperatura ambiente.
Em frequências mais baixas, as hECTs tenderam a ser mais fortes à temperatura ambiente. Quando cadenciados a 36 graus Celsius, os hECTs apresentaram maior taxa de batimento espontâneo e maior amplitude de frequências de captação. O ambiente com temperatura controlada garante a relevância fisiológica da função dos hECTs medidos.
Além disso, o banho de meio compartilhado do biorreator multitecidual facilita estudos de sinalização parácrina entre hECTs de diferentes composições celulares. A adição de SPoTs ao nosso biorreator multitecidual permite que os pesquisadores estudem eficientemente o miocárdio doente com tensão anormalmente alta ou baixa, que de outra forma escorregaria das extremidades de pinos sem tampa.
