体外研究 研究结膜杯状细胞中基于性别的差异的方法

通过研究原代培养物中的杯状细胞功能，我们获得了对基于性别的眼表健康差异背后的机制的宝贵见解。我们通过消除系统中的激素和雌激素物质，修改了已经建立的结膜杯状细胞原代培养方法，从而能够更精确地控制性激素水平。这种修改提高了我们发现的准确性和可靠性。

细胞内钙测定是一种研究杯状细胞在各种刺激下的功能以及每种刺激触发的细胞内信号通路的方法。该技术可以扩展到眼部过敏、干眼症或结膜炎等眼表疾病的药物开发。该技术有助于筛选特定激素水平下各种分子对杯状细胞的影响。

刚接触这种技术的人经常难以将结膜组织与结缔组织分开。我们的建议是密切关注组织的质地和材料特性。结膜应该是有弹性的和半透明的，而结缔组织通常颜色较浅，呈棉纤维状。

首先，使用无菌手术刀，将人体结膜组织切成一毫米的立方块。在六孔板中，在每个孔中播种四块，其中含有一毫米的完全RPMI培养基。确保将碎片固定在盘子上。

将组织碎片在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 95% 空气中孵育。每隔一天更新一次培养基。接种后 72 小时后，取下组织塞并继续孵育，直到杯状细胞达到 70% 至 80% 汇合度。

接下来，用PBS冲洗细胞，并加入0.05%胰蛋白酶EDTA以将细胞从板底部分离。在显微镜下观察细胞脱离。一旦细胞分离，加入完整的RPMI培养基以使胰蛋白酶失活。

将细胞悬液以150G离心5分钟，并将沉淀重悬于无酚红RPMI培养基中。然后将细胞悬液重新接种到玻璃底培养皿上，用于细胞内钙浓度测量。对于 Fura-2 AM 加载，将含有 0.5%HEPES、0.5% BSA 和 0.5 微摩尔 Fura-2 AM、8 微摩尔 Pluronic acid F127 和 250 微摩尔磺吡拉酮的 Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液加入含有高脚杯细胞的玻璃底培养皿中。

将细胞在 37 摄氏度下孵育一小时，保护它们免受光照。孵育后，用含有250微摩尔磺吡喃酮的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液洗涤细胞。对于细胞内钙浓度测量，将含有装有Fura-2的细胞的培养皿置于显微镜下。

然后添加 200 倍放大倍率。找到包含 20 到 50 个单元格的代表性字段。使用手绘功能，在每个单元格周围画出轮廓，以将其与背景荧光区分开来，然后等待软件自动从测量中减去背景荧光。

单击"开始实验"按钮并等待 8 到 15 秒以确定细胞中的基线钙水平。然后小心地加入胆碱能激动剂卡巴酚，并继续测量至少 120 秒或直到钙水平恢复到基线水平。使用峰值细胞内钙浓度的变化，计算每个细胞在测量的前8至15秒的平均基础钙水平。

从数据集中删除平均基础钙水平等于或高于 500 纳摩尔的细胞。接下来，计算每个细胞的最大细胞内钙浓度。然后从同一细胞的最大测量细胞内浓度中减去基础钙水平值。

最后，平均培养皿中所有细胞的峰值细胞内钙浓度的变化。通过免疫荧光染色，利用杯状细胞标志物、细胞角蛋白和 Helix pomatia 凝集素 1 特异性抗体确认人结膜杯细胞的纯度。Fura-2 AM测定结果显示，在不含酚红的RPMI和1%BSA和完全RPMI培养基中孵育的细胞之间没有显著差异。

然而，当将晚期RPMI培养基组与完全RPMI培养基组进行比较时，观察到细胞内钙对卡巴酚的反应显着增加。最重要的是获得足够细胞密度的原代人杯状细胞培养物。在生长过程中，确保组织块粘附在培养板上，以便有效生长。

研究人员可以通过在刺激前将各种抑制剂、靶向受体或信号分子应用于细胞来探索特定途径的参与。还可以评估指示杯状细胞功能的其他参数，如粘蛋白分泌和丝裂原活化蛋白激酶的失活。通过互补测量，可以全面了解杯状细胞对不同刺激的反应。