这种方法识别可行的眼结膜微生物,这是具有挑战性的,由于眼睛敌对的环境。它可以帮助回答眼微生物群是否存在,以及眼部疾病的细菌存在如何变化。与DNA测序(可识别可行和不可行微生物)不同,该方法只识别可行的微生物,从而更清楚地了解眼共体群落。
研究表明,难以诊断的眼疾,如非自身免疫和自身免疫性干眼有独特的眼部细菌存在。这种方法可用于诊断具有独特微生物特征的眼部疾病。首先自动切割适量的棉击和牙签,让老鼠数量被擦拭,然后捏掉一厘米长的棉击1/2块,然后拉到边缘,形成一个扁平的单孔层,在击球分崩离析之前停止。
在牙签尖端扭曲时轻轻握住伸出的一块,围绕牙签的一端旋转击球。成品眼拭子将有一个非常薄的棉层伸展在尖端延伸约1/2至1厘米远的尖端。将棉签插入一个小烧嘴中,向下拭子侧,然后盖住并高压灭菌。
使用消毒剂清洁工作区域,以尽量减少污染,并引用 0.5 毫升无菌脑心脏输液,或 BHI 介质放入标有 1.5 毫升无菌微离心管。将管子盖在架子上,并将机架放在冰上。从左到右设置工作流程,从小鼠麻醉站开始,该站包含带实验鼠的笼子、空无菌笼、室温麻醉、25号针头和1毫升注射器。
接下来,准备一个眼拭子站,其中含有冰上引用的 BHI、消毒眼拭子、润滑眼药水、生物危害容器、干净的纸巾和 70% 异丙酚喷雾剂。最后,设置了带室温血脂板的电镀站、10微升移液器、10微升无菌一次性提示和生物危害废物容器。通过挤压后脚垫,确保鼠标正确麻醉。
只有在没有移动的情况下才能继续。分配一只手处理麻醉小鼠,另一只手处理眼拭子和文化。将鼠标从笼子中取出,放在工作面的顶部,使其侧面露出左眼。
用异丙酚喷洒戴手套的手,用纸巾擦干。用专用介质处理手解开标记的 BHI 微型离心机管,并将两者放回机架中。将棉质涂层的眼拭子尖浸入 BHI 中,然后从管中取出拭子,同时将尖端两次旋转到内管上,以去除多余的液体并将其取出。
用鼠标处理手,轻轻地按住鼠标的脖子擦伤。另一方面,将眼睑尖端贴在左眼的中间结合区域。轻轻压低眼球,在下眼睑和眼睛之间移动拭子10次,保持恒定的压力。
无需触摸毛皮,请轻轻取出垂直于插入位置的拭子尖端。将棉签侧向下放置,直接放入带有 BHI 介质的标记微型离心机管中。将眼滴涂在擦拭的眼睛上。
如有需要,获取皮肤或毛皮拭子作为控制样本,在每个拭子之间适当消毒手套。完成后,将鼠标返回笼子。让拭子在冰上站立10至15分钟,然后消毒戴手套的手,取出拭子,同时在介质中混合尖端10次旋转。
将尖端旋转到管内壁上进行五次旋转,将其丢弃在生物危害容器中,从而提取拭子。重复每个鼠标的过程。通过在37摄氏度下静态地孵化管一小时来丰富样品。
在孵化过程中,给每个鼠标眼拭子或控制拭子贴上一个室温 TSA 板的标签,并将其分成两半。从孵化器中取出浓缩样品,放在冰上。短暂地将样品漩涡混合,然后将样品的 10 微升引到 TSA 板上,并将板倾斜以形成条状。
重复两次。在板分界线的另一边,创建 10 个点,每个点有 10 微升样品。在37摄氏度的高温下将盘子孵化18小时,两天四天,在一个干净的室内,防止阿加板干燥。
数一数条带中的殖民地。注意形态,并计算每个拭子的菌落形成单位,以形成形态相似的分离物。看看在条带中没有捕获独特生物的点。
为了便于可视化,我们在中间和右板密集地镀细菌。通常,我们观察到的眼拭子板中的细菌要少得多。请注意,有时,眼拭子可能不会产生可恢复的细菌。
此处显示了具有代表性的眼拭板,其形态多样化的分离物与 C57 黑色六只鼠标分离。对于每个不同的隔离区,殖民地被计算在条中,相对丰度被计算和绘制。对于微生物特征,细菌是从单个鼠标眼拭子板中挑选出来的,以产生主TSA板。
当生长出现时,会进行其他测试来描述或识别微生物。主板用于提供足够的接种,以扩大各自的隔离。为了识别隔离物,TSA 板在一夜之间被条纹和孵育,并进行了 MALDI-TOF MS。
此处显示的分离物示例被确定为链球菌酸性氨基尼穆斯和气管病毒。从雄性C57黑六只小鼠身上发现了明显不同水平的共生生物。链球菌酸性氨基尼穆斯、气可可病毒凝固阴性葡萄球菌和大肠杆菌从C57黑六N小鼠中分离。
在尝试此协议时,请记住,最佳结果将通过在眼拭子步骤中涂上拭子并花时间来实现。如果获得 MALDI-TOF MS 的机会有限,则可以通过微生物和生化测试识别分离物。