该方法允许精确模拟原代人造血干细胞和祖细胞中复发性白血病功能获得突变，从而研究其在白血病转化中的作用。该技术的主要优点是将基于CRISPR-Cas9的突变工程与荧光报告基因的引入相结合。这允许对纯杂合突变细胞群进行独特的鉴定、富集和跟踪。
演示该程序的将是Tommaso Sconocchia，我实验室的博士后研究员。首先，使用在线 Benchling 设计工具通过选择加号创建选项来设计单向导 RNA。然后，单击DNA序列“其次是导入DNA序列”和从数据库导入“选项。
然后输入所需的基因并选择“人类”作为物种。单击搜索“选项并选择正确的成绩单导入。选择要在其中引入双链断路的感兴趣区域。
然后选择屏幕右侧的CRISPR“选项，然后选择设计和分析指南。接下来，选择单导板“同时将导线长度保持在 20 个碱基对和 PAM 序列，以便使用 SP-Cas9 进行编辑。选择具有高靶标分数和高脱靶分数的指南，并从商业供应商处订购单向导RNA作为化学修饰的合成单向导RNA。
要设计HDR模板，请将基因组序列和编码序列导入软件以进行分子克隆。从基因组序列文件中，通过在双链断裂的五个素数端选择400个碱基对来设计左同源臂，并将该序列粘贴到新文件中。从基因组序列文件中，通过选择目标内含子的最后 150 个碱基对并将其粘贴到左同源臂之后来设计剪接受体序列。
从编码序列文件中，选择感兴趣的cDNA。密码子优化cDNA并将其插入剪接受体序列之后。在感兴趣的cDNA之后，在荧光蛋白的启动子序列之后插入三个素数聚腺苷酸化信号。
然后，插入荧光蛋白的序列和第二个但不同的聚腺苷酸化信号。从基因组序列文件中，通过在双链断裂的三个素数端选择理想的400个碱基对并在第二次聚腺苷酸化后插入序列来设计正确的同源臂。然后，创建整个模板的副本并修改感兴趣的cDNA，使其包含所需突变的序列。
用不同的荧光蛋白交换荧光蛋白。构建 HDR 模板并将其克隆到 AAV 表达载体中。对于重组AAV6制备，准备10个150毫米培养皿，每个培养皿含有1100万个HECK293T，在20毫升DMEM中补充有10%FBS，1%青霉素链霉素和25毫摩尔HEPES。
然后，将培养皿放入37摄氏度，5%二氧化碳的培养箱中24小时。小心丢弃旧培养基后，用 20 毫升补充有 10% FBS、25 毫摩尔 HEPES 和 1 毫摩尔丁酸钠的不含抗生素的 DMEM 代替。接下来，准备两个标有管一和二的15毫升管。
对于试管，加入 5 毫升还原血清培养基、60 μg 重组 AAV6 突变 HDR 质粒和 220 μg PDGM6 辅助质粒。对于二管，加入五毫升还原血清培养基和每毫升1120微升1毫克聚乙烯胺溶液。将试管二的内容物加入试管一后，涡旋30秒，然后在室温下孵育15分钟。
小心地将 1.1 毫升溶液滴入每个培养皿中，轻轻旋转。将培养皿放入37摄氏度，5%二氧化碳的培养箱中48小时。然后在每个培养皿中加入250微升0.5摩尔EDTA，并将它们放入培养箱中10分钟。
通过洗净培养皿上的细胞来收获细胞并转移到500毫升离心管中。在4摄氏度下以2000G离心10分钟，弃去上清液。通过涡旋松开沉淀，并使用AAV纯化试剂盒提取病毒。
将纯化的病毒等分后，将其储存在零下80摄氏度。解冻CD34阳性造血干细胞和祖细胞后，将细胞转移到补充有1%青霉素链霉素的10毫升预热RPMI中。在室温下以350G离心10分钟。
将细胞悬浮在造血干细胞和祖细胞保留培养基中至每毫升250， 000个细胞的浓度，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育72小时。接下来，在15毫升管中收获细胞。通过台盼蓝排除液计数并检查细胞活力。
为了制备核糖核蛋白复合物，在1.5毫升的管中加入15微克Cas9和8微克的单向导RNA，并在25摄氏度下在加热块中孵育10分钟。当核糖核蛋白复合物孵育时，将细胞以350G离心五分钟并弃去上清液。将细胞悬浮在100微升核连接溶液中后，将细胞与核糖核蛋白复合物混合并将它们转移到比色皿中。
轻轻敲击比色皿以去除任何残留的气泡后，将比色皿插入转染系统的支架并电穿孔细胞。电穿孔后立即加入400微升不含青霉素链霉素的预热造血干细胞和祖细胞保留培养基，并用细转移移液管将细胞转移到含有预热造血干细胞和不含青霉素链霉素的祖细胞保留培养基的培养板中。然后将板转移到培养箱中。
在冰上解冻含有冷冻重组AAV的小瓶，并通过将每种重组AAV6的最佳量移液到细胞悬液中来转导细胞。将细胞悬液与移液器轻轻混合后，将转导的细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育6至8小时。六到八个小时后，将细胞收集在管中，并在室温下以350 G离心五分钟。
弃去上清液，用补充有青霉素链霉素的新鲜预热造血干细胞和祖细胞保留培养基代替，并将细胞转移到细胞培养板上。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育48小时。为了对带有杂合功能获得突变的工程细胞进行流动分选，将细胞收获在 15 毫升管中，并在室温下以 350 G 离心五分钟，如前所述。
除去上清液并将细胞悬浮在含有0.1%PSA的一毫升DPBS中，并在室温下再次以350G离心5分钟。弃去上清液后，根据先前所示的细胞数，将细胞悬浮在适当体积的DPBS加0.1%BSA中。将细胞转移到配有盖子的无菌传真管中，并向细胞悬液中加入七种AAD或其他活性染料以进行活/死细胞排除。
将荧光报告蛋白双重阳性的活细胞分选到含有200微升造血干和祖细胞保留培养基的收集管中。如前所述，将分选的细胞在室温下以350 G离心5分钟后，浓度为每毫升250，000个细胞，以便在培养物中进一步扩增或直接将细胞用于功能测定。在用核糖核蛋白复合物转流和用重组AAV6病毒转导两天后，通过流式细胞术分析细胞。
检测到四个主要群体，包括没有基于HDR的基因组编辑的细胞，这些细胞既不表达GFP细胞，也不表达仅对GFP阳性的细胞，仅整合野生型构建体，仅对BFP呈阳性的细胞仅整合突变型构建体，以及GFP和BFP双阳性细胞，同时整合野生型和突变序列。为了验证杂合钙网蛋白突变的成功敲入，对仅与AAV孵育的细胞以及与核糖核蛋白和AAV一起孵育的细胞与敲入的钙网蛋白野生型和钙网蛋白缺失序列一起孵育的细胞进行了PCR。在DNA提取之前，根据两个荧光报告基因的同时表达对细胞进行分选。
凝胶电泳后，从凝胶中切除单个条带并提取DNA用于随后的Sanger测序。测序结果证实野生型和突变序列在杂合钙网状突变造血干细胞和祖细胞中成功无缝整合。尝试此过程时要记住的最重要的事情是仔细选择性能最佳的单向导RNA，因为这将决定整体HDR效率，从而决定成功敲入杂合突变的频率。
按照此过程，基因工程细胞可用于功能性体外和体内实验，例如集落形成单位测定，分化测定和移植到免疫缺陷小鼠中。
