我们的方案结合了几种技术，这些技术已被证明对长期类器官维护有效。这对于研究临床表现在发育期之外的年龄相关疾病的衰老很有用。该技术的主要优点是不需要任何专用设备或试剂。
它主要基于实验室中常见的材料。衰老和神经退行性疾病已成为一个特别有趣的点，因为我们目前的建模方法主要关注已建立的疾病表型，而不是早期发育阶段。胚胎干细胞和iPSC是非常脆弱的细胞。
初次使用的用户应该温和并有耐心。由于这些是长期培养，因此从一开始就应该耐心等待 首先，在缝合线上喷洒 70% 乙醇，并通过用手术刀的钝端磨损缝合线来制备 PLGA 微丝。将光纤放在显微镜下。
然后使用尺子开始将纤维切割成 500 微米到 1 毫米长的碎片。总共切割约25毫米的纤维，并将细丝加入含有1毫升抗生素 - 抗真菌溶液的15毫升管中。接下来，在引擎盖中，用 10 毫升 DMEM/F-12 稀释纤维溶液并涡旋以充分混合。
然后，将20微升纤维溶液加入96孔板的三个孔中。使用明场显微镜，对每孔的纤维进行计数和平均。用纤维溶液稀释或浓缩孔，平均每孔5至10个微丝。
一旦先前培养的诱导多能干细胞达到70%至80%汇合度，请在显微镜下以10或20倍放大倍率检查细胞。确保菌落显示小于 10% 的自发分化面积。用移液管吸出培养基，并用DPBS洗涤细胞一次。
然后，加入500微升细胞分离溶液或0.5毫摩尔EDTA以解离菌落，并在37摄氏度下孵育三至五分钟。接下来，向每个孔中加入一毫升新鲜的E8培养基，轻轻移液以分离所有细胞。将整个细胞悬液转移到15毫升离心管中，并加入另外一毫升新鲜E8培养基。
然后，在室温下以 290 g 离心细胞三分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于一毫升补充有50微摩尔ROCK抑制剂的E6培养基中，并使用血细胞计数器计数细胞。在补充有ROCK抑制剂的E6培养基中制备所需座位密度的细胞悬液。
然后，将150微升细胞悬液添加到96孔超低附着板的每个孔中。接下来，在室温下以290g离心板三分钟以强制聚集细胞。然后，将板在37摄氏度的加湿气氛中与5%二氧化碳孵育以进行拟胚体形成。
孵育24小时后，将板转移到罩上，并使用移液管小心地吸出120微升培养基，注意不要通过将移液器尖端降低到孔中太远来吸出胚体。接下来，向每个孔中加入150微升新鲜E6培养基，补充有两微摩尔XAV939和SMAD抑制剂。将板转移回培养箱，每天用补充有抑制剂的新鲜制备的E6替换培养基。
在孵育的第 7 天，检查所有拟胚体是否达到 550 至 600 微米的直径并显示光滑、清晰的边缘。在这个阶段，它们已准备好嵌入细胞外基质中。要嵌入类器官，通过将四英寸长的热塑性天花板薄膜板放在空的 P200 盒子上来准备凹陷包埋片。
然后，使用15毫升锥形管或500微升微量离心管，轻轻地将薄膜片压入孔中，以产生12个或所需数量的酒窝。接下来，在薄膜片上喷洒 70% 乙醇，让它在紫外线灯打开的情况下在引擎盖内干燥至少 30 分钟。同时，在冰上解冻足量的基底膜基质。
然后，使用宽口径P200尖端，将一个胚状体从96孔板转移到每个酒窝。用普通移液器吸头尽可能多地去除培养基，但不要让胚状体干燥。接下来，使用常规的预冷P200尖端，向每个类器官添加约30微升未稀释的膜基质，确保胚胎体尽可能靠近液滴的中心。
一旦所有拟胚体嵌入基质中，将薄膜片放入无菌培养皿中。然后，将培养皿在37摄氏度下在含有5%二氧化碳的潮湿气氛中孵育10分钟，以使膜基质凝固。对于类器官分化，将 5 毫升含有不含维生素 A 的 B-27 制备的分化培养基添加到超低附着 6 孔板的一个孔中。
在培养箱中将板预热至37摄氏度。膜基质凝固后，通过从薄膜片背面推出凹坑，将嵌入的拟胚体转移到 6 孔板上。如有必要，使用孔中的一毫升培养基并将其粘在薄膜上以将液滴从薄膜片上分离。
膜基质中嵌入的拟胚体分化为脑类器官，在体外白天显示出不同的出芽形成10。在体外30日，使用酒窝或夹层包埋进一步成熟类器官。长期培养显示脑类器官生长到显著大小。
在体外第七天，拟胚体显示SOX2阳性神经莲座，分散的未成熟神经元和神经祖细胞。而在体外120日，它们表现出成熟的神经元标志物，如MAP2和NeuN。这些细胞骨架标志物可以与其他有丝分裂后标志物（如双皮质素和突触素）结合使用，以探测突触可塑性和其他与年龄相关的衰退，以及星形胶质细胞和神经胶质细胞等其他脑组织。
确保组织边缘保持完整至关重要。为了尽量减少有害的剪切力，管道应缓慢完成，例如，在更换介质和类器官嵌入时。类器官生长减慢使我们能够研究早期细胞表现中的疾病进展。
类器官的产生为许多疾病的早期检测铺平了道路。
