酿酒酵母中单倍体交配效率的测定

该协议是一种简单的方法来量化不同菌株和酵母种类相互交配的效率。该方法简单、稳健、高效。该方法可以扩展到任何酵母菌株。

本研究中描述的方法可用于了解酵母中物种形成是如何发生的。此外，我们描述的菌株对于设计基因流实验特别有用。该方法的优势在于它非常简单。

根据所使用的特定菌株，可能需要进行一些细微的调整，例如孵育时间。通过将酵母提取物蛋白胨葡萄糖或YPD琼脂平板上的酵母接种物条纹，开始从冷冻原液中恢复单倍体A和Alpha。让它们在 30 摄氏度下生长 48 小时以获得单个菌落。

孵育后，从YPD板和5毫升YPD培养基中接种单个菌落，并在30摄氏度下以250RPM振荡孵育48小时。在此孵育期之后，细胞处于生长的固定阶段。在一个新的YPD板上，将配接效率网格绘制为1 x 1.5厘米的矩形，分为三个盒子，每个盒子的尺寸为1 x 0.5厘米。

在最左侧和最右侧的矩形上接种两种交配类型的 5 微升 YPD 培养物。该体积大约相当于每个部分中第五个单倍体细胞的5乘以10。将板在 30 摄氏度下孵育 24 小时。

为了混合相同数量的酵母细胞，使用无菌牙签去除外盒中产生的约1/3的酵母生长，并将去除的细胞重悬于无菌1.5毫升小瓶中的20微升水中。对每个单倍体都遵循此操作。然后，在两毫升水中稀释五微升该悬浮液，并使用600纳米的分光光度计测量光密度。

基于光密度值和一种光密度下的每毫升细胞数，在新鲜无菌的1.5毫升小瓶中加入所需体积的两个单倍体。用移液管充分混合。这种悬浮液的最终体积通常在六到八微升左右。

接下来，在中心网格中接种此悬浮液。将板在 30 摄氏度下孵育七个小时，让单倍体交配。孵育七小时后，使用牙签或移液器吸头从中心矩形刮下细胞，并用两毫升无菌水稀释。

进行进一步稀释，然后将细胞悬液散布在YPD琼脂上以获得单个菌落。铺板后，将YPD板在30摄氏度下孵育36至48小时以形成单个菌落。确保从每个交配实验中获得几百个单独的菌落进行筛选，以确保数据的统计意义。

为了鉴定平板上的二倍体菌落，通过将单个菌落单独划线到双脱落板上来转移单个菌落，缺乏菌株具有营养性的氨基酸。将板在30摄氏度下孵育48小时并计算交配效率nu。该方案的稳健性使得SK1AM和ScAM两种菌株之间的交配效率变得容易。

虽然SK1菌株的配效率非常高，但ScAM菌株的配效率相对较低。当环境中不含葡萄糖作为主碳源时，ScAM菌株的交配效率显著下降，表明交配是一个能量昂贵的过程，交替碳源的生长会定性地降低交配效率。当允许交配不同时间段时，前四到五个小时没有观察到交配。

第一个二倍体仅在四到五个小时后出现，表明这是在给定环境中完成交配过程所需的时间。之后，插拔效率迅速提高。超过七个小时，交配效率计算受到有丝分裂生长在板上开始的事实的影响。

确保混合两个单倍体的数量相等。偏离这一点将导致协议的独立重复的变化。基因流如何影响适应和物种形成是一个悬而未决的问题。

由于膨养标记物插入我们菌株中的MAT位点旁边，这有助于解决这一重要问题。