このプロトコルは、酵母の異なる株や種が互いに交配する効率を定量化する簡単な方法です。提案手法は,簡便,堅牢,効率的である.この方法は、酵母の任意の株に拡張することができる。
この研究に記載されている方法は、酵母で種分化がどのように起こるかを理解するために使用できます。さらに、我々が記載する菌株は、遺伝子流動を用いた実験を設計するのに特に有用であり得る。この方法の強みは、それが本当に単純であるということです。
使用する特定の菌株によっては、インキュベーション時間などのわずかな調整が必要になる場合があります。酵母エキスペプトンデキストロースまたはYPD寒天プレートに酵母接種材料をストリーキングすることにより、冷凍ストックから一倍体Aとアルファを復活させ始めます。単一のコロニーを得るために、摂氏30度で48時間成長させます。
インキュベーション後、YPDプレートと5ミリリットルのYPD培地から単一コロニーを接種し、摂氏30度で250RPMを振とうしながら48時間インキュベートします。細胞はこの潜伏期間の後、成長の定常期にある。新しいYPDプレートに、嵌合効率グリッドを1 x 1.5センチメートルの長方形として描き、それぞれ1 x 0.5センチメートルの寸法の3つのボックスに分割します。
左端と右端の長方形に2つの交配タイプのYPD培養液5マイクロリットルを接種します。この体積は、各切片における10〜5番目の一倍体細胞のおよそ5倍に相当する。プレートを摂氏30度で24時間インキュベートします。
同数の酵母細胞を混合するには、滅菌つまようじを使用して外箱に発生した酵母増殖の約1/3を取り除き、除去した細胞を滅菌1.5ミリリットルのバイアル内の20マイクロリットルの水に再懸濁します。各一倍体についてこれに従ってください。次に、この懸濁液5マイクロリットルを2ミリリットルの水で希釈し、分光光度計を用いて600ナノメートルの光学密度を測定する。
光学密度値および1光学密度でのミリリットル当たりの細胞数に基づいて、両方の一倍体の必要量を新鮮で滅菌済みの1.5ミリリットルバイアルに加える。ピペットを使ってよく混ぜます。この懸濁液の最終容量は、一般に約6〜8マイクロリットルです。
次に、この懸濁液を中央のグリッドに接種します。プレートを摂氏30度で7時間インキュベートし、一倍体が交尾できるようにします。7時間のインキュベーション後、つまようじまたはピペットチップを使用して中央の長方形から細胞をこすり落とし、2ミリリットルの滅菌水で希釈します。
さらに希釈を行い、次いで細胞懸濁液をYPD寒天上に広げて、単一コロニーを得る。プレーティング後、YPDプレートを摂氏30度で36〜48時間インキュベートして、単一のコロニーを作成します。データの統計的有意性を確実にするために、スクリーニングのために各交配実験から数百の個々のコロニーが取得されていることを確認してください。
プレート上の二倍体コロニーを特定するには、株が栄養要求性であるアミノ酸を欠いている二重ドロップアウトプレート上に個別にストリーキングすることによって単一コロニーを移します。プレートを摂氏30度で48時間インキュベートし、嵌合効率nuを計算します。プロトコルの堅牢性により、SK1AMとScAMの2つの系統間の交配効率を簡単に区別することができました。
SK1株は非常に高い効率で交配しましたが、ScAM株は比較的低い効率で交配しました。ScAM株の交配効率は、環境が一次炭素源としてグルコースを含まない場合、大幅に低下し、交配はエネルギー的に高価なプロセスであり、代替炭素源での成長は交配の効率を質的に低下させることを示しています。異なる期間交尾させた場合、最初の4〜5時間は交尾が観察されませんでした。
最初の二倍体は4〜5時間後にのみ出現し、これが与えられた環境で交配プロセスを完了するのに必要な時間であることを示しています。その後、嵌合効率は急速に向上しました。7時間を超えると、交配効率の計算は、有糸分裂の成長がプレート上で始まったという事実に影響されました。
同数両方の一倍体が混在していることを確認してください。これから逸脱すると、プロトコルの独立した繰り返しにばらつきが生じます。遺伝子流動が適応と種分化にどのように影響するかは未解決の問題です。
栄養要求性マーカーは、私たちの株のMAT遺伝子座の隣に挿入されているため、これはこの重要な問題に対処するのに役立ちます。
