קביעת יעילות ההזדווגות של הפלואידים ב-Saccharomyces cerevisiae

Summary

בעבודה זו מתוארת שיטה חזקה לכימות יעילות ההזדווגות בשמרים Saccharomyces cerevisiae . שיטה זו שימושית במיוחד לכימות מחסומים קדם-זיגוטיים במחקרי התמיינות.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae הוא אורגניזם מודל נפוץ בגנטיקה, אבולוציה וביולוגיה מולקולרית. בשנים האחרונות, הוא הפך גם אורגניזם מודל פופולרי ללמוד בעיות הקשורות speciation. מחזור החיים של שמרים כולל הן שלבי רבייה א-מיניים והן שלבי רבייה מינית. קלות ביצוע ניסויי האבולוציה וזמן הדור הקצר של האורגניזם מאפשרים לחקור את האבולוציה של מחסומי רבייה. היעילות שבה שני סוגי ההזדווגות (a ו-α) מזדווגים כדי ליצור את הדיפלואיד a/α מכונה יעילות ההזדווגות. כל ירידה ביעילות ההזדווגות בין הפלואידים מצביעה על מחסום קדם-זיגוטי. לכן, כדי לכמת את מידת בידוד הרבייה בין שני הפלואידים, נדרשת שיטה חזקה לכימות יעילות ההזדווגות. לשם כך מוצג כאן פרוטוקול פשוט וניתן לשחזור. הפרוטוקול כולל ארבעה שלבים עיקריים, הכוללים תיקון הפלואידים על צלחת YPD, ערבוב הפלואידים במספרים שווים, דילול וציפוי למושבות בודדות, ולבסוף חישוב היעילות בהתבסס על מספר המושבות על צלחת נשירה. סמנים אוקסוטרופיים משמשים כדי לעשות בבירור את ההבחנה בין הפלואידים לדיפלואידים.

Introduction

שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae), הנקראים בדרך כלל שמרים ניצנים, הם אאוקריוט חד-תאי. יש לו שני סוגי הזדווגות, A ו- α, והוא מציג מחזורי רבייה א-מיניים ומיניים. סוגי ההזדווגות a ו-α הם הפלואידים ויכולים להתחלק באופן מיטוטי בהיעדר סוג ההזדווגות האחר בסביבה, המייצג את המחזור הא-מיני של שמרים. כאשר שני סוגי ההזדווגות נמצאים בסמיכות, הם מפסיקים להתחלק באופן מיטוטי ומתמזגים ליצירת תא דיפלואידי. השמרים הדיפלואידים יכולים להתחלק באופן מיטוטי כאשר קיימים חומרים מזינים או לעבור מיוזה בתנאים של רעב חנקן בנוכחות מקור פחמן דל שאינו ניתן לתסיסה, כגון אצטט¹. התוצאה היא היווצרות נבגים, אשר נשארים רדומים עד שיש תנאי צמיחה נוחים. מחזור החיים מושלם כאשר הנבגים האלה נובטים, ושני סוגי ההפלואידים משתחררים חזרה לבריכה הפלואידית ^2,3 (איור 1).

ההזדווגות של תאי שמרים כוללת מספר שלבים, כגון agglutination, היווצרות היטל הזדווגות או "shmoo", ואחריו תאים והיתוך גרעיני ^4,5. שני סוגי ההזדווגות a ו-α מייצרים גורם A ו-α-factor, בהתאמה, כדי ליזום הזדווגות. גורמים אלה הם פרומונים פוליפפטידים הנקשרים לקולטנים (Ste2 ו- Ste3) הנמצאים על פני התא של סוג ההזדווגות הנגדי⁵. קשירת הפרומונים לקולטנים מתחילה את מסלול תגובת הפרומון, מסלול העברת האות^קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK) ^6,7,8. התוצאה היא עצירה של מחזור התא בשלב G1, מה שמוביל לשלב^נייח פעיל מטבולית 9. התאים מפסיקים להתחלק באופן מיטוטי, והחלבונים הדרושים להזדווגות מסונתזים. מכיוון שהתאים ההפלואידים אינם יכולים לנוע זה לעבר זה, השלכת הזדווגות או "שמו" מכוונת כלפי בן הזוג המזדווג. כאשר התאים באים במגע, דופן התא מתפרקת, והתוכן הציטופלזמי מתמזג, וכתוצאה מכך מזדווג ליצירת תא דיפלואידי^10,11. יעילות ההזדווגות בין הפלואידים שימשה כמדד לדגימה בזנים שפותחו במעבדה, כמו גם בין מינים קיימים¹².

בהיותם אורגניזם איקריוטי פשוט, שמרים הם מודל הבחירה למספר רב של שאלות מחקר הקשורות לאורגניזמים איקריוטים מורכבים. שאלה אחת כזו קשורה לספקולציה ולאבולוציה של מחסומי רבייה^13,14. עבור אורגניזמים המתרבים מינית, מין מוגדר על ידי מושג המין הביולוגי (BSC) המוצע על ידי ארנסט מאייר¹⁵. על פי תפיסה זו, שני פרטים באוכלוסייה אמורים להשתייך לשני מינים שונים אם הם אינם יכולים להתרבות זה עם זה והם מבודדים מבחינה רבייה. פירוק מחזור הרבייה המינית (הכולל מיזוג של גמטות ליצירת זיגוטה, התפתחות הזיגוטה לצאצא והשגת בגרות מינית בצאצאים) מוביל לבידוד הרבייה. כפי שניתן לראות באיור 1, מחזור החיים של S. cerevisiae דומה למחזור הרבייה המינית: א) האיחוי של שני סוגי ההזדווגות a ו-α דומה לאיחוי של גמטות באורגניזמים המתרבים מינית; ב) יכולתו של הדיפלואיד לעבור חלוקה מיטוטית שקולה להתפתחות הזיגוטה לצאצאים; ג) הדיפלואיד העובר נבג דומה לתהליך של גמטוגנזה¹⁴.

בידוד טרום זיגוטי מתרחש כאשר נצפתה הזדווגות אסורטיבית. בהינתן הזדמנות שווה להזדווג עם שני טיפוסים שונים גנטית, סוג α מעדיף להזדווג עם אחד על פני השני או להיפך¹⁴. במקרה של ניסויי אבולוציה שבהם הפלואידים התפתחו בסביבות שונות, ניתן לקבוע את נוכחותו של מחסום טרום הזדווגות על ידי ביצוע בדיקת הזדווגות. ירידה ביעילות ההזדווגות בהשוואה לאב הקדמון מצביעה על התפתחות מחסום טרום הזדווגות. בידוד פוסט-זיגוטי עלול להיווצר עקב חוסר היכולת של הדיפלואיד לעבור חלוקה מיטוטית יעילה ו/או נבגים ליצירת נבגים הפלואידים¹⁴. אלה ניתנים לכימות על ידי מדידת קצב הצמיחה של הדיפלואידים וחישוב יעילות הנבג, בהתאמה. לפיכך, כדי לחקור את האבולוציה של מחסומי הרבייה, נדרשות שיטות חזקות לכימות (א) יעילות ההזדווגות, (ב) הצמיחה המיטוטית של הדיפלואיד, ו-(ג) יעילות הנבג של הדיפלואיד. בעבודה זו מדווחת שיטה חזקה לכימות יעילות ההזדווגות של זני שמרים.

בניסויי מעבדה, אחת הדרכים שבהן ניתן לזהות את התרחשות ההזדווגות היא באמצעות סמנים אוקסוטרופיים המשלימים את הדרישות התזונתיות. כאשר שני סוגי ההזדווגות הם אוקסוטרופיים עבור שתי חומצות אמינו שונות, רק התא הדיפלואידי שנוצר על ידי איחוי של שני סוגי ההזדווגות יכול לגדול על מדיום חסר בשתי חומצות האמינו. לפיכך, סמנים auxotrophic שימושיים לזיהוי הזדווגות הן איכותית והן כמותית. בדיקה איכותנית תספיק כדי לזהות את סוג ההזדווגות של זן לאחר מיוזה¹⁶. בדיקות כמותיות חיוניות כאשר מעוניינים לזהות ירידה בהזדווגות תוך לימוד הגנים המעורבים במסלול ההזדווגות^17,18. בנוסף, כאשר שמרים נמצאים בשימוש הולך וגובר במחקרי התמיינות, יש צורך בבדיקת הזדווגות נוחה וניתנת לשחזור, שכן כימות יעילות ההזדווגות הוא מדד למחסום הקדם-זיגוטי.

יעילות ההזדווגות בין שני סוגי השמרים כומתה בעבר^16,19,20. רוב השיטות בשימוש בעבר דומות בעיצוב שלהם עם כמה וריאציות^{16,21,22,23,24,25}. חלקם משתמשים בתרביות בשלב היומן המוקדם, בעוד שאחרים משתמשים בתרביות בשלב הביניים של זנים הפלואידים. ישנן וריאציות ביחסים שבהם שני סוגי ההזדווגות מעורבים. כמעט כל הפרוטוקולים משתמשים בקרום ניטרוצלולוז. תרחיפים של שני סוגי ההזדווגות שנלקחו מתרבויות שגודלו בעבר מעורבבים ומסוננים על קרום ניטרוצלולוז המונח על צלחת YPD. באחת הווריאציות של הפרוטוקול, המתלה הפלואידי מודבק ישירות על לוחית YPD²¹. בניסויים העוסקים בגנים המעורבים בייצור הפרומונים של שני סוגי ההזדווגות, מוסיפים את הפרומונים באופן חיצוני תוך ביצוע ההשעיות של שני סוגי ההזדווגות²⁴.

לאחר הדגירה במשך מספר שעות (בדרך כלל סביב 5 שעות) לאחר ערבוב ההפלואידים, התאים נשטפים מהממברנה, מדוללים ומצופים על מדיה סלקטיבית. באחת השיטות המוקדמות יותר שדווחו בשנת 1973, היעילות של היווצרות זיגוטה או הזדווגות חושבה על ידי ספירת מספר התאים הניצנים, תאים ללא ניצנים וזוגות הזדווגות תחת מיקרוסקופ באמצעות המוציטומטר²⁶. עם זאת, רוב השיטות שדווחו מאוחר יותר משתמשות בסמנים אוקסוטרופיים כדי להבחין בין הפלואידים לדיפלואידים. יעילות ההזדווגות מחושבת כאחוז התאים הדיפלואידים ביחס למספר התאים הדיפלואידים וההפלואידים במאגר התאי 16,21,23.

עם זאת, למרות מספר דיווחים המשתמשים בשמרים כאורגניזם מודל לחקר התמיינות, עד כה לא דווח בספרות פרוטוקול סטנדרטי לחישוב יעילות ההזדווגות. תאים בשלב היומן עשויים שלא להיות אידיאליים לכימות יעילות ההזדווגות. במהלך ההזדווגות, מחזור התאים של שני הפלואידים נעצר, ולכן התאים במהלך ההזדווגות אינם מתחלקים⁹. מכיוון שמחזור התא ידוע גם ככזה שנעצר באופן דומה בתאים בשלב²⁷ הנייח, שימוש בתאים כאלה יכול להפוך את הפרוטוקול ליותר ניתן לשחזור. ניתן לערבב תאי פאזה נייחים ולפרוס אותם על לוחות YPD (כלומר, סביבה עשירה מבחינה תזונתית) לצורך הזדווגות. ההליכים הקונבנציונליים דורשים גם קרום ניטרוצלולוז ושטיפת התאים, מה שהופך את התהליך למסורבל ועלול להתמודד עם טעויות. בנוסף, הפרוטוקולים ששימשו עד כה מכמתים את יעילות ההזדווגות במונחים של הפלואיד אחד. עם זאת, בעת מדידת בידוד הרבייה, יעילות ההזדווגות מכומתת עבור שילוב מסוים של הפלואידים ולא עבור הפלואיד יחיד.

כדי להתמודד עם בעיות אלה, אנו מדווחים כאן על שיטה חזקה לכימות יעילות ההזדווגות בשמרים שהיא מאוד ניתנת לשחזור וקלה לשימוש. יתר על כן, שיטה זו וזני השמרים המשמשים כאן יכולים לשמש גם במחקרים הבוחנים את השפעת זרימת הגנים על האבולוציה של מחסומי הזדווגות.

במחקר זה נעשה שימוש בשני זנים שונים של S. cerevisiae. אחד הזנים נגזר מרקע SK1; זה שונה במעבדה שלנו על ידי הוספת הסמנים auxotrophic ליד מוקד MAT. הגנוטיפים המתקבלים של הפלואידים מוצגים בטבלה 1^28,29,30. בזן SK1, בהפלואיד הוכנס הגן TRP1 ליד מוקד ה-MAT, ובהפלואיד α הוכנס הגן LEU2 ליד מוקד ה-MAT. בזן ה-Scam הוכנסו הגנים TRP1 ו-URA3 להפלואידים a ו-α, בהתאמה. מיקום ההחדרה היה באזור ARS של כרומוזום III (Chr III: 197378..197609). עבור הפרוטוקול המדווח כאן, סמנים אוקסוטרופיים בכל מקום בגנום יספיקו. עם זאת, הימצאות הסמנים האוקסוטרופיים ליד מוקד MAT פירושה כי זנים אלה יכולים לשמש גם למחקרים הבוחנים את ההשפעה של זרימת גנים על speciation^31,32. הסמנים נוספו קרוב למוקד MAT כדי למנוע ערבוב מחדש של הסמנים עקב רקומבינציה. לפיכך, פרוטוקול זה יכול לשמש לכימות יעילות ההזדווגות במחקרים הכוללים ספקולציה וגם כדי לזהות את השינוי ביעילות ההזדווגות כאשר חוקרים את החלבונים המעורבים במסלול ההזדווגות.