هذا البروتوكول هو طريقة بسيطة لتحديد الكفاءة التي تتزاوج بها سلالات وأنواع مختلفة من الخميرة مع بعضها البعض. الطريقة المقترحة بسيطة وقوية وفعالة. يمكن تمديد الطريقة لتشمل أي سلالة من الخميرة.
يمكن استخدام الطريقة الموضحة في هذه الدراسة لفهم كيفية حدوث الانتواع في الخميرة. علاوة على ذلك، يمكن أن تكون السلالات التي نصفها مفيدة بشكل خاص لتصميم تجارب على تدفق الجينات. تكمن قوة الطريقة في أنها بسيطة حقا.
قد تكون هناك حاجة إلى بعض التعديلات الطفيفة مثل وقت الحضانة اعتمادا على سلالة معينة مستخدمة. ابدأ في إحياء الصبغيات الفردية A و Alpha من المخزونات المجمدة عن طريق وضع لقاح الخميرة على مستخلص الخميرة بيبتون دكستروز ، أو صفيحة أجار YPD. اسمح لهم بالنمو لمدة 48 ساعة عند 30 درجة مئوية للحصول على مستعمرات واحدة.
بعد الحضانة ، قم بتلقيح مستعمرات مفردة من صفيحة YPD وخمسة ملليلتر من وسط YPD ، واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة مع اهتزاز 250 دورة في الدقيقة. الخلايا في مرحلة ثابتة من النمو بعد فترة الحضانة هذه. على لوحة YPD جديدة ، ارسم شبكة كفاءة التزاوج كمستطيل 1 × 1.5 سم مقسم إلى ثلاثة صناديق ، كل منها بأبعاد 1 × 0.5 سم.
تلقيح خمسة ميكرولترات من ثقافة YPD لنوعي التزاوج على المستطيلات الموجودة في أقصى اليسار وأقصى اليمين. يناظر هذا الحجم ٥ في ١٠ أس خامس خلايا أحادية الصيغة الصبغية في كل قسم. احتضان لوحات لمدة 24 ساعة في 30 درجة مئوية.
لخلط عدد متساو من خلايا الخميرة ، قم بإزالة حوالي 1/3 من نمو الخميرة الذي تم تطويره في الصناديق الخارجية باستخدام عود أسنان معقم وأعد تعليق الخلايا التي تمت إزالتها في 20 ميكرولتر من الماء في قارورة معقمة سعة 1.5 ملليلتر. اتبع هذا لكل أحادي الصيغة الصبغية. بعد ذلك ، قم بتخفيف خمسة ميكرولترات من هذا التعليق في ملليلتر من الماء وقياس الكثافة الضوئية باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 600 نانومتر.
استنادا إلى قيمة الكثافة الضوئية وعدد الخلايا لكل مليلتر بكثافة بصرية واحدة ، أضف الأحجام المطلوبة من كل من أحادي الصيغة الصبغية في قارورة جديدة ومعقمة سعة 1.5 ملليلتر. امزجه جيدا باستخدام ماصة. الحجم النهائي لهذا التعليق بشكل عام حوالي ستة إلى ثمانية ميكرولترات.
بعد ذلك ، قم بتلقيح هذا التعليق في الشبكة المركزية. احتضان اللوحة عند 30 درجة مئوية لمدة سبع ساعات ، مما يسمح للأحاديات الصيغة الصبغية بالتزاوج. بعد سبع ساعات من الحضانة ، كشط الخلايا من المستطيل المركزي باستخدام مسواك أو طرف ماصة وتخفيفها في ملليلتر من الماء المعقم.
قم بإجراء المزيد من التخفيفات ، ثم انشر تعليق الخلية على أجار YPD للحصول على مستعمرات واحدة. بعد الطلاء ، احتضان ألواح YPD عند 30 درجة مئوية لمدة 36 إلى 48 ساعة لتطوير مستعمرات واحدة. تأكد من الحصول على بضع مئات من المستعمرات الفردية من كل تجربة تزاوج للفحص لضمان الأهمية الإحصائية للبيانات.
لتحديد المستعمرات ثنائية الصيغة الصبغية على اللوحة ، انقل المستعمرات المفردة عن طريق وضعها بشكل فردي على صفيحة مزدوجة التسرب ، تفتقر إلى الأحماض الأمينية التي تكون السلالات ذاتية التغذية من أجلها. احتضان لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة وحساب كفاءة التزاوج ، نو. مكنت متانة البروتوكول من التمييز السهل بين كفاءة التزاوج بين السلالتين ، SK1AM و ScAM.
بينما تتزاوج سلالات SK1 بكفاءة عالية جدا ، تتزاوج سلالات ScAM بكفاءة أقل نسبيا. انخفضت كفاءة التزاوج لسلالات ScAM بشكل كبير عندما لم تحتوي البيئة على الجلوكوز كمصدر أساسي للكربون ، مما يشير إلى أن التزاوج عملية مكلفة للغاية وأن النمو على مصادر الكربون البديلة يقلل نوعيا من كفاءة التزاوج. عندما سمح للتزاوج لفترات زمنية مختلفة ، لم يلاحظ أي تزاوج خلال الساعات الأربع إلى الخمس الأولى.
ظهرت ثنائيات الصبغيات الأولى فقط بعد أربع إلى خمس ساعات ، مما يشير إلى أن هذا هو الوقت اللازم لإكمال عملية التزاوج في بيئة معينة. بعد ذلك ، زادت كفاءة التزاوج بسرعة. بعد سبع ساعات ، تأثرت حسابات كفاءة التزاوج بحقيقة أن النمو الانقسامي بدأ على اللوحة.
تأكد من خلط عدد متساو من كل من أحاديات الصيغة الصبغية. ومن شأن الانحرافات عن ذلك أن تؤدي إلى اختلافات في التكرارات المستقلة للبروتوكول. كيف يؤثر تدفق الجينات على التكيف والانتواع هو سؤال مفتوح.
وبما أن الواسمات الذاتية التغذية تدخل بجوار موضع التغذية المتعددة الأطراف في السلالات، فإن هذا يساعد في الإجابة عن هذا السؤال المهم.
