Este protocolo é um método simples para quantificar a eficiência com que diferentes cepas e espécies de leveduras se acasalam entre si. O método proposto é simples, robusto e eficiente. O método pode ser estendido a qualquer cepa de levedura.
O método descrito neste estudo pode ser usado para entender como ocorre a especiação em leveduras. Além disso, as cepas que descrevemos podem ser particularmente úteis para projetar experimentos com fluxo gênico. A força do método é que ele é muito simples.
Alguns pequenos ajustes, como o tempo de incubação, podem ser necessários, dependendo da cepa específica usada. Comece a reviver os haploides A e Alpha de estoques congelados, dedilhando o inóculo de levedura em um extrato de levedura peptona dextrose, ou placa de ágar YPD. Deixe-os crescer por 48 horas a 30 graus Celsius para obter colônias únicas.
Após a incubação, inocular colônias únicas da placa YPD e cinco mililitros de meio YPD e incubar a 30 graus Celsius por 48 horas com agitação a 250 RPM. As células encontram-se na fase estacionária de crescimento após este período de incubação. Em uma placa YPD fresca, desenhe a grade de eficiência de acasalamento como um retângulo de 1 por 1,5 centímetro dividido em três caixas, cada uma com uma dimensão de 1 por 0,5 centímetro.
Inocular cinco microlitros da cultura YPD dos dois tipos de acasalamento nos retângulos mais à esquerda e mais à direita. Este volume corresponde a cerca de 5 vezes 10 a quinta células haploides em cada seção. Incubar as placas por 24 horas a 30 graus Celsius.
Para misturar um número igual de células de levedura, remova cerca de 1/3 do crescimento de levedura desenvolvido nas caixas externas usando um palito estéril e ressuspenda as células removidas em 20 microlitros de água em um frasco estéril de 1,5 mililitro. Siga isso para cada haploide. Em seguida, diluir cinco microlitros dessa suspensão em dois mililitros de água e medir a densidade óptica usando um espectrofotômetro a 600 nanômetros.
Com base no valor da densidade óptica e no número de células por mililitro em uma densidade óptica, adicione os volumes necessários de ambos os haploides em um frasco fresco e estéril de 1,5 mililitro. Misture bem usando uma pipeta. O volume final desta suspensão é geralmente em torno de seis a oito microlitros.
Em seguida, inocular essa suspensão na grade central. Incubar a placa a 30 graus Celsius por sete horas, permitindo que os haploides se acasalem. Após sete horas de incubação, raspe as células do retângulo central usando um palito ou uma ponta de pipeta e dilua em dois mililitros de água estéril.
Realizar diluições adicionais e, em seguida, espalhar a suspensão celular em ágar YPD para obter colônias únicas. Após o plaqueamento, incubar as placas de YPD a 30 graus Celsius por 36 a 48 horas para desenvolver colônias únicas. Certifique-se de que algumas centenas de colônias individuais sejam obtidas de cada experimento de acasalamento para triagem para garantir a significância estatística dos dados.
Para identificar as colônias diploides na placa, transfira as colônias únicas, strandando-as individualmente em uma placa de gotejamento duplo, sem os aminoácidos para os quais as cepas são auxotróficas. Incubar as placas a 30 graus Celsius por 48 horas e calcular a eficiência de acasalamento, nu. A robustez do protocolo permitiu fácil diferenciação da eficiência reprodutiva entre as duas linhagens, SK1AM e ScAM.
Enquanto as cepas SK1 acasalaram com uma eficiência muito alta, as cepas ScAM acasalaram com uma eficiência relativamente menor. A eficiência de acasalamento das linhagens ScAM caiu significativamente quando o ambiente não continha glicose como fonte primária de carbono, indicando que o acasalamento é um processo energeticamente caro e o crescimento em fontes alternativas de carbono reduz qualitativamente a eficiência do acasalamento. Quando permitido acasalar por diferentes períodos de tempo, nenhum acasalamento foi observado nas primeiras quatro a cinco horas.
Os primeiros diploides apareceram somente após quatro a cinco horas, indicando que este é o tempo necessário para que o processo de acasalamento seja concluído no ambiente dado. Depois disso, a eficiência de acasalamento aumentou rapidamente. Após sete horas, os cálculos de eficiência de acasalamento foram influenciados pelo fato de que o crescimento mitótico começou na placa.
Certifique-se de que o mesmo número de ambos os haploides sejam misturados. Desvios disso levariam a variações nas repetições independentes do protocolo. Como o fluxo gênico afeta a adaptação e a especiação é uma questão em aberto.
Uma vez que os marcadores auxotróficos são inseridos próximos ao locus MAT em nossas linhagens, isso ajuda a resolver essa importante questão.
