通过免疫淘选富集成年小鼠背根神经节神经元培养物

该协议使我们能够增强成年小鼠背根神经节培养物中的神经元数量。这可能有助于确定神经元细胞对给定反应的贡献。我们在基本的DRG培养方案中增加了一个免疫淘选步骤。

主要优点是选择针对非神经元细胞。如果您不熟悉原发性 DRG 培养，最好练习解剖以获得尽可能多的 DRG，并尽可能多地修剪神经。首先，吸出用于包被培养板的聚-D-赖氨酸，并用组织培养水洗涤板三次。

倾斜盖子，让表面完全干燥。将足够的层粘连蛋白涂在板上以涂覆每个孔的底部，并将其置于37摄氏度的培养箱中。用D-PBS清洗先前准备好的CD45，PDGFR-β和O4淘洗盘。

对于CD45培养皿，加入5毫升0.2%BSA和20微升CD45一抗。对于 PDGFR-β 培养皿，将 15.2 微升 PDGFR-β 添加到 5 毫升含 0.2% BSA 的平板中。对于 O4 培养皿，将 2 毫升 O4 杂交瘤加入 3 毫升 0.2% BSA 和另外 100 微升 4%BSA，以确保最终 BSA 浓度保持在 0.2%接下来，用 30 毫升 0.9% 冰冷盐水灌注安乐死小鼠。

观察肝脏颜色的变化以确保灌注。将前爪和后爪别在泡沫塑料平台上，并使用干净的剃须刀片从背部露出脊柱。通过在脊柱背侧切开大约一半深的切口，切除脊柱的背半部分以露出脊髓来进行椎板切除术。

要么轻轻切断神经并移除脊髓，要么轻轻地将脊髓推到一边，保持神经完整性。在解剖显微镜下，使用脊神经根从脊柱两侧找到并去除所有背根神经节或DRG。去除每个DRG的神经碎片时，修剪其，因为培养物中更多的神经碎片可能导致生存率低下。

将DRG收集在冰上的锥形管中，将15毫升HBSS中的DRG，并让它们沉降到底部。使用移液器从DRG中吸出大部分HBSS，并在管中留下约100微升液体，以避免丢失组织。用1毫升HBSS洗涤三次，并向组织中加入5毫升先前解冻的工作STEMxyme溶液。

用透明薄膜盖住盖子，然后将管子侧浮在 37 摄氏度的水浴中一小时。与酶孵育后，向管中加入1毫升低卵木样抑制剂溶液。用P1000移液器轻轻研磨细胞10至15次，并让组织块沉降。

然后将含有解离细胞的顶部2至3毫升溶液转移到新鲜的低卵粘蛋白溶液中，并重复直到组织完全解离，并且没有可见块残留。在室温下以300×g离心管10分钟。如前所述，使用移液管除去上清液后，将细胞沉淀重悬于1毫升淘洗缓冲液中，然后轻轻移液混合。

在50毫升锥形管上用1毫升淘洗缓冲液预润湿70微米细胞过滤器，然后通过细胞过滤器过滤细胞溶液。用1毫升淘洗缓冲液清洗试管，然后将其通过过滤器。对于细胞分层，加入2毫升15%BSA，并轻轻涂覆封闭管的侧面。

为了去除髓磷脂碎片，通过将移液器靠在管的侧面，在BSA垫子的顶部，一次小心地将细胞悬液分层一毫升。在室温下以300×g离心管10分钟，缓慢加速和减速。中间髓鞘层显示白色物质片。

使用 P1000 移液器，一次取出一毫升，去除顶部的透明液体、中间的髓磷脂相和 BSA，留下约 100 微升以免干扰沉淀。对于抗原修复，加入 5 毫升淘洗缓冲液并将试管在 37 摄氏度和 10% 二氧化碳培养箱中孵育 30 至 45 分钟。接下来，用D-PBS清洗孵育的CD45培养皿三次，然后倒出最后的冲洗液。

然后将细胞悬液倒入CD45培养皿中。将培养皿在室温下孵育20分钟，每隔10分钟轻轻旋转一次，以使细胞平等地获得抗体。轻轻摇晃 CD45 培养皿并以一定角度支撑它。

小心地将1毫升细胞悬液移过培养皿上，以收集未结合的细胞。然后将其转移到PDGFR-β培养皿中，先前用D-PBS洗涤三次，并孵育。如前所述，将未结合的细胞从PDGFR-β培养皿转移到O 4培养皿中，并孵育板。

孵育后，将细胞悬液转移到15毫升锥形管中，并以300×g离心10分钟。将细胞重悬至所需体积，并用台盼蓝稀释至1:1的比例以获得细胞活力。使用血细胞计数器，计数中到大细胞。

取出层粘连蛋白并立即以所需密度接种细胞，在孵育板之前不让它们干燥。固定、完整和免疫泛选的DRG培养物用β3-微管蛋白染色神经元，DAPI染色所有细胞核。确定整个DRG培养物具有约42.36%的β3-微管蛋白染色，免疫泛选的DRG培养物具有约71.44%的β3-微管蛋白染色，这表明免疫淘选的神经元富集显着增加。

小心治疗组织非常重要。轻柔地处理DRG，修剪多余的神经，注意不要搅动或失去组织和培养物，这些都是需要注意的关键。