Questo protocollo ci consente di aumentare il numero di neuroni nelle colture di gangli dorsali di topo adulto. Questo può aiutare a determinare il contributo delle cellule neuronali a una data risposta. Abbiamo aggiunto una fase di immunopanning a un protocollo di coltura DRG di base.
Il vantaggio principale è quello di selezionare contro le cellule non neuronali. Se sei nuovo alle culture DRG primarie, è meglio praticare le dissezioni per ottenere il maggior numero possibile di DRG e tagliare il più possibile il nervo. Per iniziare, aspirare la poli-D-lisina utilizzata per il rivestimento della piastra di coltura e lavare la piastra tre volte con acqua di coltura tissutale.
Inclinare il coperchio aperto e lasciare asciugare completamente la superficie. Applicare abbastanza laminina alla piastra per rivestire il fondo di ciascun pozzetto e posizionarlo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Lavare i piatti di panning precedentemente preparati di CD45, PDGFR-beta e O4 con D-PBS.
Per il piatto CD45, aggiungere 5 millilitri di 0,2% BSA e 20 microlitri di anticorpo primario CD45. Per il piatto PDGFR-beta, aggiungere 15,2 microlitri di PDGFR-beta ai 5 millilitri di piastra contenente BSA allo 0,2%. Per il piatto O4, aggiungere 2 millilitri di ibridoma O4 a 3 millilitri di 0,2% BSA e altri 100 microlitri di 4% BSA, per garantire che la concentrazione finale di BSA rimanga allo 0,2% Successivamente, perfondere il topo eutanasia con 30 millilitri di soluzione salina ghiacciata allo 0,9%.
Osservare il cambiamento di colore del fegato per garantire la perfusione. Appuntare le zampe anteriori e posteriori a uno stadio di polistirolo e utilizzare una lama di rasoio pulita per esporre la colonna vertebrale dalla parte posteriore. Eseguire una laminectomia effettuando tagli a circa metà strada su entrambi i lati della colonna vertebrale dorsale, rimuovendo la metà dorsale della colonna per esporre il midollo spinale.
Tagliare delicatamente i nervi e rimuovere il midollo spinale, o spingere delicatamente il cavo di lato, mantenendo l'integrità del nervo. Sotto un microscopio a dissezione, utilizzare le radici del nervo spinale per trovare e rimuovere tutti i gangli della radice dorsale, o DRG, da entrambi i lati della colonna vertebrale. Tagliare i detriti nervosi da ogni DRG mentre viene rimosso, poiché più detriti nervosi nella coltura possono portare a una scarsa sopravvivenza.
Raccogliere i DRG in 15 millilitri di HBSS in un tubo conico sul ghiaccio e lasciarli depositare sul fondo. Utilizzando una pipetta, aspirare la maggior parte dell'HBSS dai DRG e lasciare circa 100 microlitri di liquido nel tubo, per evitare di perdere il tessuto. Lavare tre volte con 1 millilitro di HBSS e aggiungere 5 millilitri di soluzione STEMxyme precedentemente scongelata al tessuto.
Coprire il coperchio con una pellicola trasparente e far galleggiare il tubo su un lato in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius, per un'ora. Dopo l'incubazione con l'enzima, aggiungere 1 millilitro di soluzione inibitrice ovomucoide bassa al tubo. Triturare delicatamente le cellule con una pipetta P1000 da 10 a 15 volte e lasciare che i pezzi di tessuto si depositino.
Quindi trasferire i primi 2-3 millilitri della soluzione contenente cellule dissociate in una soluzione ovomucoide fresca a basso contenuto e ripetere fino a quando il tessuto è completamente dissociato e non rimangono pezzi visibili. Centrifugare il tubo per 10 minuti a 300 x g a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il surnatante usando una pipetta, come dimostrato in precedenza, risospendere il pellet cellulare in 1 millilitro di tampone panoramico e pipettare delicatamente per miscelare.
Pre-bagnare un filtro cellulare da 70 micrometri con 1 millilitro di tampone panoramico su un tubo conico da 50 millilitri, quindi filtrare la soluzione cellulare attraverso il filtro cellulare. Lavare il tubo con 1 millilitro di tampone panoramico e passarlo attraverso il colino. Per la stratificazione cellulare, aggiungere 2 millilitri di 15% BSA e rivestire delicatamente i lati del tubo chiuso.
Per rimuovere i detriti di mielina, stratificare accuratamente la sospensione cellulare un millilitro alla volta mediante pipettaggio contro il lato del tubo, sulla parte superiore del cuscino BSA. Centrifugare il tubo a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente, con lenta accelerazione e decelerazione. Lo strato medio di mielina mostra scaglie di materiale bianco.
Utilizzando una pipetta P1000, rimuovere il liquido trasparente sulla parte superiore, la fase mielinica in mezzo, e il BSA, un millilitro alla volta, lasciando circa 100 microlitri in modo da non disturbare il pellet. Per il recupero dell'antigene, aggiungere 5 millilitri di tampone panoramico e incubare il tubo in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 10% di anidride carbonica per 30-45 minuti. Quindi, lavare il piatto CD45 incubato tre volte con D-PBS e versare il risciacquo finale.
Quindi versare la sospensione cellulare nel piatto CD45. Incubare il piatto per 20 minuti a temperatura ambiente, ruotando delicatamente a intervalli di 10 minuti per consentire alle cellule di ottenere un accesso uguale all'anticorpo. Agitare delicatamente il piatto CD45 e appoggiarlo ad angolo.
Pipettare accuratamente 1 millilitro della sospensione cellulare sul piatto, per raccogliere le cellule non legate. Quindi trasferirlo nel piatto PDGFR-beta, precedentemente lavato tre volte con D-PBS, e incubare. Trasferire le cellule non legate dal piatto PDGFR-beta al piatto O4, come dimostrato in precedenza, e incubare la piastra.
Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 300 x g per 10 minuti. Risospendere le cellule nel volume desiderato e diluire in un rapporto di 1: 1 con blu tripano per la vitalità cellulare. Utilizzando un emocitometro, contare le cellule medio-grandi.
Rimuovere la laminina e placcare immediatamente le cellule alla densità desiderata, senza lasciarle asciugare prima di incubare la piastra. Le colture DRG fisse, intere e immunopannate sono state colorate con beta3-tubulina per i neuroni e DAPI per tutti i nuclei. È stato determinato che le colture di DRG intere hanno una colorazione di circa il 42,36% di beta3-tubulina e le colture di DRG immunopannate sono state determinate per avere circa il 71,44% di colorazione della beta3-tubulina, che rivela un aumento significativo dell'arricchimento neuronale con immunopanning.
Trattare il tessuto con cura è molto importante. Maneggiare delicatamente i DRG, tagliare il nervo in eccesso e fare attenzione a non agitare o perdere tessuti e colture sono tutti elementi cruciali di cui essere consapevoli.
