Este protocolo nos permite mejorar el número de neuronas en cultivos de ganglios de raíces dorsales de ratones adultos. Esto puede ayudar a determinar la contribución de las células neuronales a una respuesta dada. Hemos agregado un paso de inmunopanización a un protocolo básico de cultivo de DRG.
La principal ventaja es seleccionar contra células no neuronales. Si eres nuevo en los cultivos primarios de DRG, es mejor practicar disecciones para obtener tantos DRG como sea posible y recortar la mayor cantidad de nervio posible. Para comenzar, aspire la poli-D-lisina utilizada para recubrir la placa de cultivo y lave la placa tres veces con agua de cultivo de tejidos.
Incline la tapa y deje que la superficie se seque completamente. Aplique suficiente laminina a la placa para cubrir el fondo de cada pocillo y colóquela en una incubadora a 37 grados centígrados. Lave los platos de barrido previamente preparados de CD45, PDGFR-beta y O4 con D-PBS.
Para el plato CD45, agregue 5 mililitros de BSA al 0,2% y 20 microlitros de anticuerpo primario CD45. Para la placa PDGFR-beta, agregue 15.2 microlitros de PDGFR-beta a los 5 mililitros de placa que contiene BSA al 0.2%. Para el plato de O4, agregue 2 mililitros de hibridoma de O4 a 3 mililitros de 0.2% BSA, y 100 microlitros adicionales de 4% BSA, para garantizar que la concentración final de BSA permanezca en 0.2%A continuación, perfunda el ratón sacrificado con 30 mililitros de solución salina helada al 0.9%.
Observe el cambio en el color del hígado para asegurar la perfusión. Fije las patas delanteras y traseras a una etapa de espuma de poliestireno y use una cuchilla de afeitar limpia para exponer la columna vertebral desde la parte posterior. Realice una laminectomía haciendo cortes aproximadamente a la mitad de profundidad a cada lado de la columna vertebral dorsal, eliminando la mitad dorsal de la columna para exponer la médula espinal.
Corte suavemente los nervios y retire la médula espinal, o empuje suavemente la médula hacia un lado, manteniendo la integridad nerviosa. Bajo un microscopio de disección, use las raíces nerviosas espinales para encontrar y eliminar todos los ganglios de la raíz dorsal, o DRG, de cada lado de la columna vertebral. Recorte los restos nerviosos de cada GRD a medida que se eliminan, ya que más restos nerviosos en el cultivo pueden conducir a una supervivencia deficiente.
Recoja los DRG en 15 mililitros de HBSS en un tubo cónico sobre hielo y permita que se asienten en el fondo. Usando una pipeta, aspire la mayor parte del HBSS de los DRG y deje aproximadamente 100 microlitros de líquido en el tubo, para evitar perder el tejido. Lave tres veces con 1 mililitro de HBSS y agregue 5 mililitros de solución STEMxyme de trabajo previamente descongelada al pañuelo.
Cubra la tapa con una película transparente y flote el tubo de lado en un baño de agua de 37 grados centígrados, durante una hora. Después de la incubación con la enzima, agregue 1 mililitro de solución inhibidora ovomucoide baja al tubo. Triture las células suavemente con una pipeta P1000 de 10 a 15 veces y deje que los trozos de tejido se asienten.
Luego transfiera los 2 a 3 mililitros superiores de la solución que contiene células disociadas a una solución fresca de bajo ovomucoide, y repita hasta que el tejido esté completamente disociado y no queden trozos visibles. Centrifugar el tubo durante 10 minutos a 300 x g a temperatura ambiente. Después de retirar el sobrenadante con una pipeta, como se demostró anteriormente, vuelva a suspender el pellet celular en 1 mililitro de tampón de barrido y pipetear suavemente para mezclar.
Humedezca previamente un filtro celular de 70 micrómetros con 1 mililitro de tampón de movimiento sobre un tubo cónico de 50 mililitros y luego filtre la solución celular a través del filtro celular. Lave el tubo con 1 mililitro de tampón de barrido y páselo a través del colador. Para la estratificación celular, agregue 2 mililitros de BSA al 15% y cubra suavemente los lados del tubo cerrado.
Para eliminar los restos de mielina, coloque cuidadosamente la suspensión celular un mililitro a la vez pipeteando contra el costado del tubo, encima del cojín BSA. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente, con aceleración y desaceleración lentas. La capa media de mielina muestra escamas de material blanco.
Con una pipeta P1000, retire el líquido transparente en la parte superior, la fase de mielina intermedia y el BSA, un mililitro a la vez, dejando aproximadamente 100 microlitros para no alterar el pellet. Para la recuperación de antígenos, agregue 5 mililitros de tampón de barrido e incube el tubo en una incubadora de 37 grados centígrados y 10% de dióxido de carbono durante 30 a 45 minutos. A continuación, lave el plato CD45 incubado tres veces con D-PBS y vierta el enjuague final.
Luego vierta la suspensión celular en el plato CD45. Incubar el plato durante 20 minutos a temperatura ambiente, girando suavemente a intervalos de 10 minutos para permitir que las células obtengan el mismo acceso al anticuerpo. Agite suavemente el plato CD45 y sosténgalo en ángulo.
Pipetear cuidadosamente 1 mililitro de la suspensión celular sobre el plato, para recoger las células no unidas. Luego transfiéralo a la placa PDGFR-beta, previamente lavada tres veces con D-PBS, e incube. Transfiera las células no unidas de la placa PDGFR-beta a la placa O4, como se demostró anteriormente, e incube la placa.
Después de la incubación, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugar a 300 x g durante 10 minutos. Resuspender las células en el volumen deseado y diluir a una proporción de 1:1 con azul de tripano para la viabilidad celular. Con un hemocitómetro, cuente las células medianas a grandes.
Retire la laminina e inmediatamente coloque las células en la densidad deseada, sin dejar que se sequen antes de incubar la placa. Los cultivos DRG fijos, enteros e inmunopanizados se tiñeron con beta3-tubulina para las neuronas y DAPI para todos los núcleos. Se determinó que los cultivos completos de DRG tenían aproximadamente 42,36% de tinción de beta3-tubulina, y se determinó que los cultivos de DRG inmunopanizados tenían aproximadamente 71,44% de tinción de beta3-tubulina, lo que revela un aumento significativo en el enriquecimiento neuronal con inmunopanización.
Tratar el tejido con cuidado es muy importante. Manejar los DRG suavemente, recortar el exceso de nervio y tener cuidado de no agitar o perder tejido y cultivo son cruciales a tener en cuenta.
