이 프로토콜을 사용하면 성인 마우스 후근 신경절 배양에서 뉴런 수를 향상시킬 수 있습니다. 이것은 주어진 반응에 대한 신경 세포의 기여도를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기본 DRG 배양 프로토콜에 면역패닝 단계를 추가했습니다.
가장 큰 장점은 비 신경 세포에 대해 선택하는 것입니다. 1차 DRG 배양을 처음 접하는 경우 해부를 연습하여 가능한 한 많은 DRG를 얻고 가능한 한 많은 신경을 다듬는 것이 가장 좋습니다. 먼저, 배양 플레이트 코팅에 사용된 폴리-D-라이신을 흡인하고, 조직 배양수로 플레이트를 3회 세척한다.
뚜껑을 기울이고 표면을 완전히 건조시킵니다. 각 웰의 바닥을 코팅하기에 충분한 라미닌을 플레이트에 바르고 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 이전에 준비된 CD45, PDGFR-베타 및 O4의 패닝 접시를 D-PBS로 세척합니다.
CD45 접시의 경우 5 밀리리터의 0.2 % BSA와 20 마이크로 리터의 CD45 1 차 항체를 추가합니다. PDGFR-베타 접시의 경우, 0.2% BSA-함유 플레이트 5밀리리터에 PDGFR-베타 15.2마이크로리터를 첨가한다. O4 접시의 경우 2 밀리리터의 O4 하이브리도마를 3 밀리리터의 0.2 % BSA에 추가하고 100 마이크로 리터의 4 % BSA를 추가하여 최종 BSA 농도가 0.2 %로 유지되도록합니다. 다음으로, 안락사 된 마우스에 30 밀리리터의 0.9 % 얼음 차가운 식염수로 관류하십시오.
관류를 보장하기 위해 간 색의 변화를 관찰하십시오. 앞발과 뒷발을 스티로폼 단계에 고정하고 깨끗한 면도날을 사용하여 뒤에서 척추를 노출시킵니다. 등쪽 척추의 양쪽을 절반 정도 절개하고 척수를 노출시키기 위해 기둥의 등쪽 절반을 제거하여 추궁 절제술을 수행합니다.
부드럽게 신경을 자르고 척수를 제거하거나 코드를 옆으로 부드럽게 밀어 신경 무결성을 유지하십시오. 해부 현미경으로 척수 신경근을 사용하여 척추 양쪽에서 모든 후근 신경절 또는 DRG를 찾아 제거합니다. 배양에 더 많은 신경 파편이 있으면 생존율이 저하될 수 있으므로 각 DRG에서 신경 파편을 제거할 때 제거합니다.
얼음 위의 원뿔형 튜브에 15밀리리터의 HBSS에 DRG를 수집하고 바닥에 가라앉도록 합니다. 피펫을 사용하여 DRG에서 대부분의 HBSS를 흡인하고 튜브에 약 100마이크로리터의 액체를 남겨 조직 손실을 방지합니다. 1 밀리리터의 HBSS로 3 번 세척하고 이전에 해동 된 STEMxyme 용액 5 밀리리터를 조직에 첨가하십시오.
투명 필름으로 뚜껑을 덮고 섭씨 37도의 수조에 튜브를 옆으로 눕혀 1시간 동안 눕힙니다. 효소와 함께 배양 한 후, 1 밀리리터의 저 오보 뮤 코이드 억제제 용액을 튜브에 첨가한다. P1000 피펫으로 세포를 부드럽게 10-15회 분쇄하고 조직 덩어리가 가라앉도록 합니다.
그런 다음 해리 된 세포를 함유 한 용액의 상단 2-3 밀리리터를 신선한 저 오보 뮤 코이드 용액으로 옮기고 조직이 완전히 해리되고 눈에 보이는 덩어리가 남지 않을 때까지 반복하십시오. 실온에서 300 x g에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다. 앞서 시연된 바와 같이 피펫을 사용하여 상청액을 제거한 후, 세포 펠릿을 1 밀리리터의 패닝 완충액에 재현탁하고, 부드럽게 피펫팅하여 혼합한다.
50밀리리터 원뿔형 튜브 위에 1밀리리터의 패닝 버퍼로 70마이크로미터 셀 스트레이너를 미리 적신 다음 셀 스트레이너를 통해 셀 용액을 여과합니다. 1밀리리터의 패닝 버퍼로 튜브를 세척하고 스트레이너에 통과시킵니다. 세포 층화를 위해 2 밀리리터의 15 % BSA를 추가하고 닫힌 튜브의 측면을 부드럽게 코팅합니다.
미엘린 파편을 제거하려면 BSA 쿠션 위에 튜브 측면에 피펫팅하여 세포 현탁액을 한 번에 1밀리리터씩 조심스럽게 겹칩니다. 튜브를 300 x g에서 실온에서 10분 동안 천천히 가속 및 감속하면서 원심분리합니다. 중간 미엘린 층은 백색 물질의 박편을 나타낸다.
P1000 피펫을 사용하여 상단의 투명한 액체, 그 사이의 미엘린 상 및 BSA를 한 번에 1밀리리터씩 제거하고 펠릿을 방해하지 않도록 약 100마이크로리터를 남깁니다. 항원 회수를 위해 5 밀리리터의 패닝 버퍼를 추가하고 섭씨 37도 및 10 % 이산화탄소 인큐베이터에서 30-45 분 동안 튜브를 배양합니다. 다음으로, 배양된 CD45 접시를 D-PBS로 3회 세척하고, 최종 헹굼물을 붓는다.
그런 다음 세포 현탁액을 CD45 접시에 붓습니다. 실온에서 20 분 동안 접시를 배양하고 세포가 항체에 동등하게 접근 할 수 있도록 10 분 간격으로 부드럽게 소용돌이 치십시오. CD45 접시를 부드럽게 흔들어 비스듬히 받쳐줍니다.
결합되지 않은 세포를 수집하기 위해 접시 위에 세포 현탁액 1 밀리리터를 조심스럽게 피펫팅합니다. 그런 다음 D-PBS로 미리 세 번 세척한 PDGFR-베타 접시에 옮기고 배양합니다. 앞서 설명한 바와 같이 결합되지 않은 세포를 PDGFR-베타 접시에서 O4 접시로 옮기고 플레이트를 배양합니다.
인큐베이션 후, 세포 현탁액을 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 300 x g에서 10 분 동안 원심 분리한다. 원하는 부피의 세포를 재현탁하고 세포 생존율을 위해 트리판 블루와 1:1의 비율로 희석합니다. 혈구계를 사용하여 중대형 세포까지 계산합니다.
라미닌을 제거하고 플레이트를 배양하기 전에 건조시키지 않고 원하는 밀도로 세포를 즉시 플레이트합니다. 고정, 전체 및 면역팬 DRG 배양물을 뉴런에 대한 베타3-튜불린과 모든 핵에 대한 DAPI로 염색했습니다. 전체 DRG 배양물은 약 42.36%의 베타3-튜불린 염색을 갖는 것으로 결정되었고, 면역팬닝된 DRG 배양물은 약 71.44%의 베타3-튜불린 염색을 갖는 것으로 결정되었으며, 이는 면역패닝에 의한 뉴런 농축의 상당한 증가를 보여줍니다.
조심스럽게 조직을 치료하는 것은 매우 중요합니다. DRG를 부드럽게 다루고, 과도한 신경을 다듬고, 조직과 배양을 동요시키거나 잃지 않도록 주의하는 것은 모두 알고 있어야 합니다.
