يسمح لنا هذا البروتوكول بتعزيز عدد الخلايا العصبية في ثقافات العقد الجذرية الظهرية للفأر البالغ. قد يساعد هذا في تحديد مساهمة الخلايا العصبية في استجابة معينة. لقد أضفنا خطوة مناعية إلى بروتوكول ثقافة DRG الأساسي.
الميزة الرئيسية هي الاختيار ضد الخلايا غير العصبية. إذا كنت جديدا في ثقافات DRG الأولية ، فمن الأفضل ممارسة التشريح للحصول على أكبر عدد ممكن من DRGs ، وتقليم أكبر قدر ممكن من العصب. للبدء ، قم بنضح poly-D-lysine المستخدم لطلاء لوحة الثقافة ، واغسل اللوحة ثلاث مرات بماء زراعة الأنسجة.
قم بإمالة الغطاء واترك السطح يجف تماما. ضع كمية كافية من اللامينين على الطبق لتغطية قاع كل بئر ، وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية. اغسل أطباق الغسل المعدة مسبقا من CD45 و PDGFR-beta و O4 باستخدام D-PBS.
بالنسبة لطبق CD45 ، أضف 5 ملليلتر من 0.2٪ BSA و 20 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي CD45. بالنسبة لطبق PDGFR-beta ، أضف 15.2 ميكرولتر من PDGFR-beta إلى 5 ملليلتر من اللوحة المحتوية على 0.2٪ BSA. بالنسبة لطبق O4 ، أضف 2 ملليلتر من الورم الهجين O4 إلى 3 ملليلتر من 0.2٪ BSA ، و 100 ميكرولتر إضافي من 4٪ BSA ، لضمان بقاء تركيز BSA النهائي عند 0.2٪ بعد ذلك ، قم بتغذية الماوس الرحيم ب 30 ملليلتر من محلول ملحي بارد بنسبة 0.9٪.
مراقبة التغير في لون الكبد لضمان التروية. ثبت الكفوف الأمامية والخلفية على مرحلة الستايروفوم ، واستخدم شفرة حلاقة نظيفة لفضح العمود الفقري من الخلف. قم بإجراء استئصال الصفيحة الفقرية عن طريق إجراء جروح بعمق نصف تقريبا على جانبي العمود الفقري الظهري ، وإزالة النصف الظهري من العمود لكشف الحبل الشوكي.
إما قطع الأعصاب برفق وإزالة الحبل الشوكي ، أو دفع الحبل برفق إلى الجانب ، والحفاظ على سلامة الأعصاب. تحت مجهر التشريح ، استخدم جذور الأعصاب الشوكية للعثور على وإزالة جميع العقد الجذرية الظهرية ، أو DRGs ، من جانبي العمود الفقري. قم بقص حطام الأعصاب من كل DRG أثناء إزالته ، لأن المزيد من حطام الأعصاب في المزرعة قد يؤدي إلى ضعف البقاء على قيد الحياة.
اجمع DRGs في 15 ملليلتر من HBSS في أنبوب مخروطي على الجليد ، واسمح لها بالاستقرار في القاع. باستخدام ماصة ، قم بشفط معظم HBSS من DRGs ، واترك ما يقرب من 100 ميكرولتر من السائل في الأنبوب ، لتجنب فقدان الأنسجة. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1 ملليلتر من HBSS ، وأضف 5 ملليلتر من محلول STEMxyme العامل المذاب مسبقا إلى الأنسجة.
قم بتغطية الغطاء بغشاء شفاف ، وقم بتعويم الأنبوب على جانبه في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة مع الإنزيم ، أضف 1 ملليلتر من محلول مثبط البويضات المنخفض إلى الأنبوب. سحن الخلايا برفق باستخدام ماصة P1000 من 10 إلى 15 مرة ، واترك قطع الأنسجة تستقر.
ثم انقل أعلى 2 إلى 3 ملليلتر من المحلول الذي يحتوي على خلايا منفصلة إلى محلول بيضوي منخفض جديد ، وكرر حتى يتم فصل الأنسجة تماما ، ولا تبقى قطع مرئية. جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة 10 دقائق عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة المادة الطافية باستخدام ماصة ، كما هو موضح سابقا ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحريك ، وخلط ماصة برفق.
قم بتبليل مصفاة خلية 70 ميكرومتر مسبقا ب 1 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحريك فوق أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر ، ثم قم بتصفية محلول الخلية من خلال مصفاة الخلية. اغسل الأنبوب ب 1 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحريك ، وقم بتمريره عبر المصفاة. لطبقات الخلايا ، أضف 2 ملليلتر من 15٪ BSA وقم بتغطية جوانب الأنبوب المغلق برفق.
لإزالة حطام المايلين ، ضع بعناية طبقة تعليق الخلية ملليلتر واحد في كل مرة عن طريق السحب على جانب الأنبوب ، أعلى وسادة BSA. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، مع تسارع بطيء وتباطؤ. تظهر طبقة الميالين الوسطى رقائق من مادة بيضاء.
باستخدام ماصة P1000 ، قم بإزالة السائل الصافي في الأعلى ، ومرحلة المايلين بينهما ، و BSA ، ملليلتر واحد في كل مرة ، مع ترك ما يقرب من 100 ميكرولتر حتى لا تزعج الحبيبات. لاسترجاع المستضد ، أضف 5 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحريك واحتضان الأنبوب في حاضنة 37 درجة مئوية و 10٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 إلى 45 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل طبق CD45 المحتضن ثلاث مرات باستخدام D-PBS ، واسكب الشطف النهائي.
ثم صب تعليق الخلية في طبق CD45. احتضن الطبق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مع الدوران برفق على فترات 10 دقائق للسماح للخلايا بالوصول على قدم المساواة إلى الجسم المضاد. هز طبق CD45 برفق وادعمه بزاوية.
ماصة بعناية 1 ملليلتر من تعليق الخلية على الطبق ، لجمع الخلايا غير المنضمة. ثم نقله إلى طبق PDGFR-beta ، الذي سبق غسله ثلاث مرات باستخدام D-PBS ، واحتضانه. انقل الخلايا غير المنضمة من طبق PDGFR-beta إلى طبق O4 ، كما هو موضح سابقا ، واحتضان اللوحة.
بعد الحضانة ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الخلايا بالحجم المطلوب ، وقم بتخفيفها إلى نسبة 1: 1 باستخدام التريبان الأزرق لصلاحية الخلية. باستخدام مقياس الدم ، عد الخلايا المتوسطة إلى الكبيرة.
قم بإزالة اللامينين وقم على الفور بطلاء الخلايا بالكثافة المطلوبة ، دون السماح لها بالجفاف قبل احتضان اللوحة. تم تلطيخ مزارع DRG الثابتة والكاملة والمناعية ببيتا 3-توبولين للخلايا العصبية و DAPI لجميع النوى. تم تحديد مزارع DRG الكاملة على أنها تحتوي على ما يقرب من 42.36٪ من تلطيخ بيتا 3-توبولين ، وتم تحديد مزارع DRG المناعية على أنها تحتوي على ما يقرب من 71.44٪ من تلطيخ بيتا 3 توبولين ، مما يكشف عن زيادة كبيرة في إثراء الخلايا العصبية بالمناعة.
علاج الأنسجة بعناية مهم جدا. إن التعامل مع DRGs بلطف ، وتقليم الأعصاب الزائدة ، والحرص على عدم إثارة أو فقدان الأنسجة والثقافة كلها أمور حاسمة يجب أن تكون على دراية بها.
