Этот протокол обеспечивает эффективную и воспроизводимую дифференцировку коричневых адипоцитов, которые экспрессируют ключевые адипогенные факторы транскрипции, маркеры зрелых адипоцитов и обладают термогенным потенциалом и морфологическим фенотипом зрелых коричневых адипоцитов. Это простая и воспроизводимая двухфазная процедура дифференцировки для получения клеток с характеристиками зрелых коричневых адипоцитов из межлопаточной коричневой жировой ткани новорожденных мышей. Этот протокол позволяет изучить механизмы активации бурой жировой ткани в качестве мишени для лечения ожирения.
Он был моделью для определения механизмов, участвующих в патофизиологии липодистрофии. Ожидается, что выполнение этой техники в первый раз будет сложным. Для достижения успешных результатов важно иметь подробный протокол и подчеркивать критические моменты.
Для начала поместите усыпленную мышь в положение лежа и с помощью острых ножниц сделайте разрез кожи длиной в один сантиметр на среднем уровне спины животного. Аккуратно снимите кожу, хирургическим путем отсоедините iBAT от тушки с помощью маленьких ножниц. Соберите обе доли iBAT с помощью плоскогубцев с изогнутым концом, чтобы удалить доли независимо друг от друга.
Поместите две доли в пластиковую пробирку с 1,5 миллилитрами стерильного PBS при комнатной температуре. Инкубируйте ткани iBAT в буфере для пищеварения коллагеназы второго типа в течение 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия с непрерывным легким встряхиванием со скоростью 800 об/мин. Механически разрушайте тканевую суспензию в буфере для пищеварения коллагеназы второго типа путем пипетирования вверх и вниз с помощью микропипетки P1000 и фильтрующих наконечников.
Используйте новый наконечник для каждого образца. Пропустите десегрегированные ткани через отдельные 100-микрометровые клеточные фильтры в новые пробирки объемом 1,5 миллилитров. Добавьте 500 микролитров буфера ACK к отфильтрованным образцам ткани.
Переверните трубки четыре-пять раз и выдерживайте при комнатной температуре в течение четырех минут. Затем пропустите суспензии через клеточное сетчатое фильтр 40 микрометров в новые пробирки объемом 1,5 миллилитра с помощью микропипетки P1000 и отфильтрованных наконечников. Центрифузия ресуспендирует гранулу, как описано в тексте рукописи.
Затем засейте каждый образец в шесть лунок 24-луночного планшета, добавив в каждую лунку по одному миллилитру суспензии. Недифференцированные преадипоциты имели очень низкие или неопределяемые уровни ppar-гамма, C/ebp-альфа, перилипина 1 и CD36. Напротив, эти маркеры были значительно выше на седьмой день дифференцировки.
Накопление множественных липидных капель в коричневых преадипоцитах согласуется с ранее опубликованными результатами. Наблюдалось значительное увеличение маркера митохондриальной массы TOM 20 и белков окислительного комплекса фосфорилирования на седьмой день дифференцировки. UCP1, бонафидный маркер этого типа клеток, не был обнаружен в недифференцированных преадипоцитах, в то время как он был в значительной степени экспрессирован в зрелых коричневых адипоцитах на седьмой день дифференцировки.
Митохондрии эволюционировали от удлиненной трубчатой формы в нулевой день к округлой или похожей на бобы форме на седьмой день. Внутренняя структура митохондрий также была изменена в результате адипогенеза, что привело к более высокой плотности параллельно упакованных кристаллов. Важно отметить, что митохондрии были тесно связаны с липидными каплями в дифференцированных коричневых адипоцитах, поэтому не было обнаружено заметного расстояния между внешней мембраной митохондрий и поверхностями липидных капель, даже с помощью просвечивающей электронной микроскопии с высоким разрешением.
Хирургическое удаление межлопаточной жировой ткани имеет решающее значение. Неэффективное количество ткани ограничивает доступность клеток, которые будут дифференцироваться. Этот метод визуализации помогает охарактеризовать морфологию дифференцированных коричневых адипоцитов in vitro.
Можно проводить анализы на функцию митохондрий, бета-андрогенную активацию и аутофагическое ингибирование.
