פרוטוקול זה מאפשר התמיינות יעילה וניתנת לשחזור של אדיפוציטים חומים המבטאים גורמי שעתוק אדיפוגניים מרכזיים, סמני אדיפוציט בוגרים, ובעלי פוטנציאל תרמוגני ופנוטיפ מורפולוגי של אדיפוציטים חומים בוגרים. זהו הליך התמיינות דו-פאזי פשוט וניתן לשכפול להשגת תאים בעלי מאפיינים של אדיפוציטים חומים בוגרים מרקמת שומן חומה בין-סקפולרית של עכברים שזה עתה נולדו. פרוטוקול זה מאפשר לחקור את מנגנוני ההפעלה של רקמת השומן החומה כיעד לטיפול בהשמנת יתר.
זה כבר מודל לקביעת המנגנונים המעורבים הפתופיזיולוגיה של lipodystrophy. ביצוע טכניקה זו בפעם הראשונה צפוי להיות מאתגר. חיוני שיהיה פרוטוקול מפורט ולהדגיש נקודות קריטיות כדי לקבל תוצאות מוצלחות.
כדי להתחיל, הניחו את העכבר המרדים במצב נוטה ובצעו חתך עור באורך סנטימטר אחד באמצע הגב של החיה באמצעות מספריים חדים. הסר את העור בזהירות, לנתק בניתוח את iBAT מן הפגר באמצעות מספריים קטנים. קצרו את שתי אונות ה-iBAT באמצעות צבת קצה עקומה כדי להסיר את האונות באופן עצמאי.
מניחים את שתי האונות בצינור פלסטיק עם 1.5 מיליליטר של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר. יש לדגור על רקמות iBAT במאגר העיכול מסוג collagenase two למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות מתמשכות ב-800 סל"ד. משבש מכנית את מתלה הרקמה בחיץ העיכול מסוג 2 של collagenase על ידי פיפטציה למעלה ולמטה באמצעות מיקרופיפטה P1000 וקצות מסנן.
השתמש בעצה חדשה עבור כל דוגמה. העבירו את הרקמות המופרדות דרך מסננות בודדות של 100 מיקרומטר לתוך צינורות חדשים של 1.5 מיליליטר. הוסף 500 מיקרוליטר של חיץ ACK לדגימות הרקמה המסוננות.
הפכו את הצינורות ארבע עד חמש פעמים ודגרו בטמפרטורת החדר במשך ארבע דקות. לאחר מכן העבירו את המתלים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינורות חדשים של 1.5 מיליליטר באמצעות מיקרופיפטה P1000 וקצוות מסוננים. צנטריפויה משהה מחדש את הגלולה כמתואר בכתב היד של הטקסט.
לאחר מכן זרעו כל דגימה בשש בארות של צלחת תרבית של 24 בארות על ידי הוספת מיליליטר אחד של התרחיף לכל באר. הפרדיפויטים הבלתי ממוינים הציגו רמות נמוכות מאוד או בלתי ניתנות לגילוי של ppar-gamma, C/ebp-alpha, perilipin 1 ו- CD36. לעומת זאת, סמנים אלה היו גבוהים משמעותית ביום השביעי של הבידול.
הצטברות טיפות שומנים מרובות בפראדיפוציטים החומים הייתה עקבית עם התוצאות שפורסמו בעבר. עלייה משמעותית נצפתה בסמן המסה המיטוכונדריאלית TOM 20 וברמות החלבון של קומפלקס הזרחן החמצוני ביום השביעי להתמיינות. UCP1, סמן בונאפיד מסוג תא זה לא זוהה בפראדיפוציטים לא ממוינים בעוד שהוא בא לידי ביטוי משמעותי באדיפוציטים חומים בוגרים ביום השביעי להתמיינות.
המיטוכונדריה התפתחו מצורה צינורית מוארכת ביום האפס לצורה מעוגלת או דמוית שעועית ביום השביעי. המבנה הפנימי של המיטוכונדריה השתנה גם הוא על ידי אדיפוגנזה, וכתוצאה מכך צפיפות גבוהה יותר של הקריסטה הדחוסה המקבילה. חשוב לציין שהמיטוכונדריה היו קשורים קשר הדוק לטיפות שומנים באדיפוציטים החומים המובחנים, כך שלא ניתן היה להבחין במרחק ניכר בין הקרום החיצוני של המיטוכונדריה לבין פני השטח של טיפות השומנים, אפילו במיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה.
הסרה כירורגית של רקמת שומן interscapular הוא קריטי. כמות לא יעילה של רקמה מגבילה את זמינות התאים שיתמיינו. טכניקת הדמיה זו מסייעת לאפיין את המורפולוגיה של אדיפוציטים חומים מובחנים במבחנה.
ניתן לבצע בדיקות לתפקוד מיטוכונדריאלי, הפעלה בטא אנדרוגנית ועיכוב אוטופגי.
