Ce protocole permet la différenciation efficace et reproductible des adipocytes bruns qui expriment les principaux facteurs de transcription adipogéniques, les marqueurs adipocytaires matures, et qui ont un potentiel thermogénique et un phénotype morphologique des adipocytes bruns matures. Il s’agit d’une procédure de différenciation en deux phases simple et reproductible permettant d’obtenir des cellules présentant des caractéristiques d’adipocytes bruns matures à partir de tissu adipeux brun interscapulaire de souris nouveau-nées. Ce protocole permet d’étudier les mécanismes d’activation du tissu adipeux brun comme cible pour le traitement de l’obésité.
Il a été un modèle pour déterminer les mécanismes impliqués dans la physiopathologie de la lipodystrophie. Effectuer cette technique pour la première fois s’annonce difficile. Il est essentiel d’avoir un protocole détaillé et de mettre l’accent sur les points critiques pour avoir des résultats réussis.
Pour commencer, placez la souris euthanasiée en position couchée et faites une incision cutanée d’un centimètre de long au milieu du dos de l’animal à l’aide de ciseaux tranchants. Retirez la peau avec précaution, détachez chirurgicalement l’iBAT de la carcasse à l’aide de petits ciseaux. Récoltez les deux lobes iBAT à l’aide d’une pince à pointe incurvée pour retirer les lobes indépendamment.
Placez les deux lobes dans un tube en plastique avec 1,5 millilitre de PBS stérile à température ambiante. Incuber les tissus iBAT dans un tampon de digestion de type collagénase deux pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius avec une légère agitation continue à 800 tr/min. Perturber mécaniquement la suspension tissulaire dans le tampon de digestion de la collagénase de type deux en pipetant de haut en bas à l’aide d’une micropipette P1000 et d’embouts filtrants.
Utilisez une nouvelle astuce pour chaque échantillon. Faites passer les tissus désagrégés à travers des crépines individuelles de 100 micromètres dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre. Ajoutez 500 microlitres de tampon ACK aux échantillons de tissus filtrés.
Retournez les tubes quatre à cinq fois et incubez à température ambiante pendant quatre minutes. Ensuite, passez les suspensions à travers une crépine à cellules de 40 micromètres dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre à l’aide d’une micropipette P1000 et d’embouts filtrés. Centrifusion remet la pastille en suspension comme décrit dans le manuscrit du texte.
Ensuite, ensemencez chaque échantillon dans six puits d’une plaque de culture de 24 puits en ajoutant un millilitre de suspension dans chaque puits. Les préadipocytes indifférenciés présentaient des niveaux très faibles ou indétectables de ppar-gamma, C/ebp-alpha, perilipin 1 et CD36. En revanche, ces marqueurs étaient significativement plus élevés au septième jour de différenciation.
L’accumulation de plusieurs gouttelettes lipidiques dans les préadipocytes bruns était cohérente avec les résultats précédemment publiés. Une augmentation significative a été observée des niveaux de marqueur de masse mitochondriale TOM 20 et de protéine du complexe de phosphorylation oxydative au septième jour de la différenciation. UCP1, un marqueur de bonne foi de ce type de cellule, n’a pas été détecté dans les préadipocytes indifférenciés alors qu’il était substantiellement exprimé dans les adipocytes bruns matures au septième jour de la différenciation.
Les mitochondries ont évolué d’une forme tubulaire allongée au jour zéro à une forme arrondie ou semblable à un haricot au septième jour. La structure interne mitochondriale a également été modifiée par l’adipogenèse, ce qui a entraîné une densité plus élevée des cristaux empilés parallèles. Il est important de noter que les mitochondries étaient intimement associées aux gouttelettes lipidiques dans les adipocytes bruns différenciés, de sorte qu’aucune distance discernable entre la membrane externe des mitochondries et les surfaces des gouttelettes lipidiques n’a pu être détectée, même avec la microscopie électronique à transmission à haute résolution.
L’ablation chirurgicale du tissu adipeux interscapulaire est essentielle. Une quantité inefficace de tissu limite la disponibilité des cellules qui seront différenciées. Cette technique d’imagerie permet de caractériser la morphologie des adipocytes bruns différenciés in vitro.
Il est possible d’effectuer des tests pour la fonction mitochondriale, l’activation bêta-androgène et l’inhibition autophagique.
