このプロトコルは、主要な脂肪形成転写因子、成熟脂肪細胞マーカーを発現し、成熟褐色脂肪細胞の熱発生可能性と形態学的表現型を有する褐色脂肪細胞の効率的かつ再現性のある分化を可能にします。これは、新生仔マウスの肩甲骨間褐色脂肪組織から成熟褐色脂肪細胞の特徴を持つ細胞を得るための、単純で複製可能な二相分化法です。このプロトコルは、肥満を治療するための標的としての褐色脂肪組織の活性化メカニズムを研究することを可能にします。
これは、脂肪異栄養症の病態生理学に関与するメカニズムを決定するためのモデルとなっています。この手法を初めて行うのは大変な作業です。成功するためには、詳細なプロトコルを用意し、重要なポイントを強調することが不可欠です。
まず、安楽死させたマウスを腹臥位に置き、鋭利なハサミを使用して動物の背中の中央に1センチメートルの長さの皮膚切開を行います。皮膚を慎重に取り除き、小さなハサミを使用して死体からiBATを外科的に取り外します。カーブチッププライヤーを使用して両方のiBATローブを収穫し、ローブを個別に除去します。
2つのローブを、室温で1.5ミリリットルの滅菌PBSを入れたプラスチックチューブに入れます。iBAT組織をコラゲナーゼ2型消化バッファーで摂氏37度、45分間インキュベートし、800 RPMで穏やかに振とうを続けてインキュベートします。コラゲナーゼ2型消化バッファー中の組織懸濁液を機械的に破壊するには、P1000マイクロピペットとフィルターチップを使用してピペッティングします。
サンプルごとに新しいチップを使用します。分離された組織を個々の100マイクロメートルのセルストレーナーに通し、新しい1.5ミリリットルのチューブに入れます。ろ過した組織サンプルに500マイクロリットルのACKバッファーを加えます。
チューブを4〜5回反転させ、室温で4分間インキュベートします。次に、懸濁液を40マイクロメートルのセルストレーナーに通し、P1000マイクロピペットとフィルターチップを使用して新しい1.5ミリリットルチューブに入れます。Centrifusionは、テキスト原稿に記載されているようにペレットを再懸濁します。
次に、各ウェルに1ミリリットルの懸濁液を添加することにより、各サンプルを24ウェル培養プレートの6つのウェルに播種します。未分化の前駆脂肪細胞は、ppar-γ、C/ebp-α、ペリリピン1、CD36のレベルが非常に低いか検出不能であった。対照的に、これらのマーカーは分化の7日目に有意に高かった。
褐色前駆脂肪細胞における複数の脂肪滴の蓄積は、以前に発表された結果と一致していました。分化7日目には、ミトコンドリア質量マーカーTOM 20および酸化的リン酸化複合体タンパク質レベルで有意な増加が観察されました。この細胞型の真正なマーカーであるUCP1は、未分化の前駆細胞では検出されませんでしたが、分化の7日目に成熟した褐色脂肪細胞で実質的に発現していました。
ミトコンドリアは、0日目の細長い管状から、7日目の丸みを帯びた、または豆のような形に進化しました。ミトコンドリアの内部構造も脂肪形成によって修飾され、平行に詰まったクリステの密度が高くなりました。重要なことに、ミトコンドリアは分化した褐色脂肪細胞の脂肪滴と密接に関連していたため、高分解能透過型電子顕微鏡でも、ミトコンドリアの外膜と脂肪滴の表面との間の識別可能な距離を検出できませんでした。
肩甲骨間脂肪組織の外科的切除は重要です。組織の非効率的な量は、分化される細胞の利用可能性を制限します。このイメージング技術は、in vitroで分化した褐色脂肪細胞の形態を特徴付けるのに役立ちます。
ミトコンドリア機能、ベータアンドロゲン活性化、およびオートファジー阻害のアッセイを行うことが可能です。
