通过全细胞膜片钳技术 记录 H9c2心肌细胞上的电压依赖性钾电流

该协议成功记录了乌头碱对H9C2细胞IKv的影响。从离子通道的角度推进药物心脏毒性机制研究的新阶段。全细胞膜片钳技术是离子通道研究的金标准，具有高灵敏度、高精度和高特异性。

全细胞膜片钳技术可用于探索并列门控多系统疾病（如心血管系统和神经系统）的特定离子通道的药理学或毒性机制。首先，一旦H9C2培养皿汇合80%，用0.25%胰蛋白酶消化细胞30秒。用普通培养基或含有药物的培养基在35毫米的培养皿中用玻璃板在37摄氏度下培养24小时，在5%二氧化碳气氛和70至80%相对湿度下培养2次每毫升10至第5个细胞。

打开微量移液器拉拔器并预热 30 分钟。然后将带有细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管放在微量移液器拉拔器上。选择程序，然后单击控制面板上的回车键。

点击右上角的斜坡程序，确定玻璃毛细管的热值。根据斜坡测试确定的值编写拉电极的程序，然后单击拉动开始制造移液器。打开数字模拟转换器、信号放大器、显微机械手、显微镜和相机。

依次打开成像应用程序、信号放大器软件和数据采集软件。单击采集，然后在数据采集软件中选择编辑协议。在波形界面中编辑程序。

输入纪元 A、纪元 B 和纪元 C 的第一级、增量级别、第一持续时间和增量持续时间的值，然后单击模式速率界面并设置试验层次结构数据。接下来，单击编辑协议以选择激励按钮，并在PM泄漏减法对话框中设置泄漏减法程序。要建立数据存储路径，请单击文件并选择在数据采集软件中选择设置数据文件名。

然后通过选择采集并单击数据采集软件中的开放协议来打开已建立的lKv协议。最后，单击工具选项，然后选择膜测试以开始运行协议。将细胞外溶液添加到全细胞膜片钳装置上的细胞浴中，并将盖玻片向上放置，将H9C2细胞置于浴中。

用细胞外溶液填充30%的移液器，并将其安装在集成到膜片钳装置中的记录电极支架上。用记录电极支架拧紧移液器。然后用微型机械手将移液器放入浴缸中。

单击信号放大器软件的移液器偏移接口，将 lKv 电流基线保持在零皮安。用连接到记录电极支架的 1.0 毫升注射器通过塑料管手动提供适当的正压。通过三维操作显微操纵器以接触细胞来稍微移动移液器。

一旦膜测试方波在移液器接触细胞膜后下降三分之一到一半，移除正压并手动提供适当的负压。然后点击数据采集软件的补丁界面，形成gigaseal。在电池天花板期间使用电容补偿快速和电容补偿慢信号放大器软件来补偿快电容和慢电容。

施加短暂的负压脉冲以破坏细胞膜的贴片。通过单击信号放大器软件的全电池按钮执行全电池膜电容补偿。最后，通过单击数据记录按钮保存并记录数据。

使用数据分析软件打开保存的lKv数据。保存当前电压关系。单击“分析”以选择统计信息。

选择范围作为光标 1 2 进行数据分析，单击峰值幅度和平均值按钮，然后单击“确定”以查看结果页面中的数据。最后，将lKv均值数据列复制到功能绘图软件中，以便进一步分析。保存代表性的 lKv 电流迹线。

单击“编辑”以选择传输跟踪，然后选择要传输的区域中的完整跟踪。接下来，单击在迹线选择中选择，然后在信号中选择IN 0。最后，点击确定查看结果页面中的数据，并将总数据复制到功能绘图软件中，绘制当前迹线。

保存 lKv 协议。单击编辑以选择创建激励波形信号，然后选择确定。然后重复该步骤，在不选择信号的情况下绘制电流走线。

lKv由150毫秒的去极化脉冲刺激触发，从负40到正60毫伏，保持电位为负60毫伏。H9C2大鼠心肌细胞的lKv首先出现在负20毫伏左右，然后随着进一步去极化而振幅增大。与对照组相比，用1.5毫摩尔4-AP处理5分钟后，lKv振幅明显降低。

此外，在24小时AC处理后，lKv在10至60毫伏的膜电位下以剂量依赖性方式显着降低。记录离子通道后的单个细胞，可用于进一步的单细胞组学评估，例如单细胞基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学。