このプロトコルは、H9C2細胞のIKvに対するアコニチンの効果を正常に記録します。薬物の心毒性メカニズムをイオンチャネルの観点から解明するための新たなフェーズを推進。全細胞パッチクランプ技術は、高感度、高精度、高特異性を備えたイオンチャネル研究のゴールドスタンダードです。
全細胞パッチクランプ技術は、心血管系や神経系などの多系統疾患に対して特定のイオンチャネルを並置する薬理学的または毒性メカニズムを探索するために使用できます。まず、H9C2培養皿が80%コンフルエントになったら、細胞を0.25%トリプシンで30秒間消化します。ガラス板を敷いた35ミリ皿に、通常培地または薬剤含有培地で1ミリリットルあたり10〜5細胞を2回培養し、炭酸ガス雰囲気5%、相対湿度70〜80%で37°Cで24時間培養する。
マイクロピペットプラーの電源を入れ、30分間予熱します。次に、フィラメント付きのホウケイ酸ガラスキャピラリーをマイクロピペットプーラーに置きます。プログラムを選択し、コントロールパネルのEnterをクリックします。
右上隅にあるランププログラムをクリックして、ガラスキャピラリーの熱値を決定します。ランプテストで決定された値に従って電極を引っ張るためのプログラムを作成し、引っ張ってピペットの製造を開始します。デジタルアナログコンバーター、信号アンプ、マイクロマニピュレーター、顕微鏡、カメラの電源を入れます。
イメージングアプリケーション、信号増幅ソフトウェア、データ収集ソフトウェアを順番に開きます。[取得]をクリックし、データ収集ソフトウェアでプロトコルの編集を選択します。波形インターフェイスでプログラムを編集します。
エポック A、エポック B、およびエポック C の第 1 レベル、デルタ レベル、最初の期間、およびデルタ期間の値を入力します。次に、モード レート インターフェイスをクリックし、試行階層データを設定します。次に、プロトコルの編集をクリックして刺激ボタンを選択し、PMリーク減算ダイアログボックスでリーク減算プログラムを設定します。データストレージパスを確立するには、ファイルをクリックし、データ集録ソフトウェアでデータファイル名の設定を選択します。
次に、データ集録ソフトウェアで[取得]を選択し、[オープンプロトコル]をクリックして、確立されたlKvプロトコルを開きます。最後に、ツールオプションをクリックし、メンブレンテストを選択してプロトコルの実行を開始します。細胞外溶液を全細胞パッチクランプ装置の細胞浴に加え、カバースリップをH9C2細胞とともに浴中に置きます。
ピペットの30%を細胞外溶液で満たし、パッチクランプ装置に組み込まれた記録電極ホルダーに取り付けます。記録電極ホルダーでピペットを締めます。次に、マイクロマニピュレーターでピペットをバスに落とします。
信号増幅器ソフトウェアのピペットオフセットインターフェースをクリックして、lKv電流ベースラインをゼロピコアンペアに維持します。プラスチックチューブを介して、記録電極ホルダーに接続された1.0ミリリットルのシリンジを使用して、適切な陽圧を手動で供給します。マイクロマニピュレーターを3次元で操作してピペットを少し動かし、細胞に接触させます。
ピペットが細胞膜に触れた後、膜テストの方形波が3分の1から半分低下したら、陽圧を取り除き、手動で適切な負圧を供給します。次に、データ収集ソフトウェアのパッチインターフェースをクリックして、ギガシールを形成します。セル天井中に静電容量補償高速および静電容量補償低速信号増幅ソフトウェアを使用して、高速および低速容量を補償します。
負圧の短いパルスを適用して、細胞膜のパッチを破裂させます。信号増幅器ソフトウェアの全セルボタンをクリックして、全細胞膜静電容量補償を実行します。最後に、データ記録ボタンをクリックして、データを保存して記録します。
保存したlKvデータをデータ解析ソフトで開きます。現在の電圧関係を保存します。[分析]をクリックして統計を選択します。
データ分析のために範囲をカーソル1 2として選択し、ピーク振幅と平均ボタンをクリックしてから、OKをクリックして結果ページにデータを表示します。最後に、lKv平均データの列を関数描画ソフトウェアにコピーして、さらに分析します。代表的なlKv電流トレースを保存します。
[編集] をクリックして転送トレースを選択し、転送するリージョン内の完全なトレースを選択します。次に、トレース選択で選択をクリックし、信号でIN 0を選択します。最後に、[OK]をクリックして結果ページにデータを表示し、合計データを関数描画ソフトウェアにコピーして現在のトレースを描画します。
lKv プロトコルを保存します。編集をクリックして刺激波形信号の作成を選択し、OKを選択します。次に、信号を選択せずに電流トレースを描画する手順を繰り返します。
lKvは、マイナス60ミリボルトの保持電位でマイナス40ミリボルトからプラス60ミリボルトまでの150ミリ秒の脱分極パルス刺激によってトリガーされました。H9C2ラット心筋細胞のlKvは、最初にマイナス20ミリボルト付近に現れ、その後、振幅はさらなる脱分極とともに増加した。対照群と比較して、lKv振幅は、1.5ミリモルの4-APによる5分間の処理後に観察可能に減少した。
さらに、lKvは、24時間のAC処理後、用量依存的に10〜60ミリボルトの膜電位で有意に減少した。イオンチャネルを記録した後の個々の細胞を、シングルセルゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、およびメタボロミクスなどのさらなるシングルセルオミクス評価に使用することができる。
