이 프로토콜은 H9C2 세포의 IKv에 대한 아코 니틴의 효과를 성공적으로 기록합니다. 이온 채널의 관점에서 약물의 심장 독성 메커니즘을 조사하기위한 새로운 단계를 촉진합니다. 전체 세포 패치 클램프 기술은 고감도, 고정밀 및 높은 특이성을 갖춘 이온 채널 연구의 황금 표준입니다.
전체 세포 패치 클램프 기술은 심혈관계 및 신경계와 같은 다기관 질환에 대한 특정 이온 채널을 병치하는 약리학적 또는 독성 메커니즘을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면 H9C2 배양 접시가 80% 합류가 되면 30초 동안 0.25% 트립신으로 세포를 소화합니다. 5% 이산화탄소 분위기 및 70 내지 80% 상대 습도로 24시간 동안 유리판이 깔린 35mm 접시에 유리판이 깔린 35mm 접시에 일반 배지 또는 약물 함유 배지로 밀리리터당 10 내지 5번째 세포를 배양한다.
마이크로 피펫 풀러를 켜고 30 분 동안 예열하십시오. 그런 다음 마이크로 피펫 풀러에 필라멘트가있는 붕규산 유리 모세관을 놓습니다. 프로그램을 선택하고 제어판에서 Enter 키를 클릭하십시오.
오른쪽 상단 모서리에 있는 램프 프로그램을 클릭하여 유리 모세관의 발열량을 결정합니다. 램프 테스트에 의해 결정된 값에 따라 전극을 당기는 프로그램을 작성하고 당기기를 클릭하여 피펫 제작을 시작합니다. 디지털 아날로그 변환기, 신호 증폭기, 마이크로 매니퓰레이터, 현미경 및 카메라를 켭니다.
이미징 어플리케이션, 신호 증폭기 소프트웨어 및 데이터 수집 소프트웨어를 순차적으로 엽니다. 수집을 클릭하고 데이터 수집 소프트웨어에서 프로토콜 편집을 선택합니다. 파형 인터페이스에서 프로그램을 편집합니다.
epoch A, epoch B 및 epoch C에 대한 첫 번째 레벨, 델타 레벨, 첫 번째 기간 및 델타 기간에 대한 값을 입력합니다.그런 다음 모드 속도 인터페이스를 클릭하고 평가판 계층 구조 데이터를 설정합니다. 그런 다음 프로토콜 편집을 클릭하여 자극 버튼을 선택하고 PM 누출 빼기 대화 상자에서 누출 빼기 프로그램을 설정합니다. 데이터 스토리지 경로를 설정하려면 파일을 클릭하고 데이터 수집 소프트웨어에서 데이터 파일 이름 설정을 선택합니다.
그런 다음 데이터 수집 소프트웨어에서 개방형 프로토콜 획득을 선택하고 클릭하여 설정된 lKv 프로토콜을 엽니다. 마지막으로 도구 옵션을 클릭하고 멤브레인 테스트를 선택하여 프로토콜 실행을 시작합니다. 세포 외 용액을 전체 세포 패치 클램프 장치의 세포 배스에 추가하고 커버 슬립을 H9C2 세포와 함께 위쪽으로 수조에 놓습니다.
피펫의 30%를 세포외 용액으로 채우고 패치 클램프 장치에 통합된 기록 전극 홀더에 설치합니다. 기록 전극 홀더로 피펫을 조입니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터로 피펫을 욕조에 떨어 뜨립니다.
신호 증폭기 소프트웨어의 파이펫 오프셋 인터페이스를 클릭하여 lKv 전류 기준선을 제로 피코암페어로 유지합니다. 플라스틱 튜브를 통해 기록 전극 홀더에 연결된 1.0 밀리리터 주사기로 적절한 양압을 수동으로 전달합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 3차원으로 조작하여 피펫을 약간 움직여 셀과 접촉합니다.
피펫이 세포막에 닿은 후 멤브레인 테스트 구형파가 1/3에서 1/2로 떨어지면 양압을 제거하고 적절한 음압을 수동으로 전달합니다. 그런 다음 데이터 수집 소프트웨어의 패치 인터페이스를 클릭하여 gigaseal을 형성하십시오. 셀 천장 동안 커패시턴스 보상 빠른 및 커패시턴스 보상 느린 신호 증폭기 소프트웨어를 사용하여 빠르고 느린 커패시턴스를 보상하십시오.
세포막의 패치를 파열시키기 위해 짧은 음압 펄스를 적용하십시오. 신호 증폭기 소프트웨어의 전체 셀 버튼을 클릭하여 전체 셀 멤브레인 커패시턴스 보상을 실행합니다. 마지막으로 데이터 기록 버튼을 클릭하여 데이터를 저장하고 기록합니다.
데이터 분석 소프트웨어로 저장된 lKv 데이터를 엽니다. 현재 전압 관계를 저장합니다. 분석을 클릭하여 통계를 선택합니다.
데이터 분석을 위해 범위를 커서 1 2로 선택하고 피크 진폭 및 평균 버튼을 클릭한 다음 확인을 클릭하여 결과 페이지에서 데이터를 봅니다. 마지막으로 추가 분석을 위해 lKv 평균 데이터의 열을 함수 그리기 소프트웨어에 복사합니다. 대표적인 lKv 전류 트레이스를 저장합니다.
편집을 클릭하여 전송 추적을 선택한 다음 전송할 지역의 전체 추적을 선택합니다. 그런 다음 추적 선택에서 선택을 클릭하고 신호에서 IN 0을 선택합니다. 마지막으로 확인을 클릭하여 결과 페이지에서 데이터를 보고 전체 데이터를 함수 그리기 소프트웨어에 복사하여 현재 추적을 그립니다.
lKv 프로토콜을 저장합니다. 편집을 클릭하여 자극 파형 신호 생성을 선택하고 확인을 선택합니다. 그런 다음 신호를 선택하지 않고 전류 트레이스를 그리는 단계를 반복합니다.
lKv는 마이너스 60 밀리 볼트의 유지 전위에서 마이너스 40에서 플러스 60 밀리 볼트까지 150 밀리 초의 탈분극 펄스 자극에 의해 트리거되었습니다. H9C2 쥐 심근 세포의 lKv는 처음에는 마이너스 20 밀리 볼트 부근에서 나타 났으며, 그 후 진폭은 추가 탈분극으로 증가했습니다. 대조군과 비교하여, lKv 진폭은 1.5 밀리몰 4-AP로 5 분 처리 한 후에 관찰 가능하게 감소되었다.
또한, lKv는 24 시간 AC 처리 후 용량 의존적 방식으로 10에서 60 밀리 볼트의 막 전위에서 크게 감소했습니다. 개별 세포는 이온 채널을 기록한 후, 단일 세포 유전체학, 전사체학, 단백질체학 및 대사체학과 같은 추가 단일 세포 체학 평가에 사용될 수 있습니다.
