基于RPA-CRISPR/Cas12a-SPM和深度学习的DNA病毒检测系统

我们的方案引入了一种快速且高度灵敏的青蛙病毒 3 检测系统。值得注意的是，这种方法能够对DNA病毒进行即时检测，在预防大流行性疾病的发生方面发挥着至关重要的作用。该技术的主要优势在于它将RPA与CRISPR / Cas12a系统集成，并辅以基于智能手机的便携式显微镜和AI分类。

这种集成显著提高了检测效率和准确性，同时减少了人为因素造成的错误。首先，在反应缓冲液中加入四种关键的RPA酶。然后将预先设计的引物添加到混合物中。

彻底涡旋混合物。向每个 RPA 反应中加入 1 微升从青蛙病毒 3 获得的靶 DNA，并涡旋混合均匀。接下来，吸取 7 微升 100 毫摩尔氯化镁以引发反应。

将混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟以完成测定。用CRISPR RNA制备Lachnospiraceae细菌CAS12a蛋白，形成功能性复合物。混合细菌蛋白和 10 X CRISPR/Cas12a 反应缓冲液。

现在添加 500 纳摩尔单链 DNA 报告探针。向 CRISPR/Cas12a CRISPR RNA 反应混合物中加入 1 微升 RPA 反应产物。将混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

用酶标仪测量荧光信号。为了使用智能手机显微镜进行检测，首先将准备好的反应混合物移液到退缩的载玻片上。然后在孵育前用盖玻片盖住它。

将载玻片放在智能手机显微镜的载物台上，并调整焦距和清晰度。捕获图像以测量荧光信号。使用 ImageJ 测量每幅图像的平均灰度值和浓度组中平均灰度值的标准差。

采用深度学习模型 AlexNet 33 进行分类。现在使用 Python 将输入图像调整为 224 x 224 乘以三个通道。最后，使用预训练的骨干网络和ImageNet数据集来提取图像特征。

第六对引物提供了最大的扩增效率，并被选中。CRISPR RNA-3被证明是最有效的侧支切割方法。使用具有选定 RPA 引物和 CRISPR RNA 的开发检测系统导致 10 aM FV3 和对照组之间存在显着差异。

要记住的最重要的一点是具体的 CAS 12a 检测步骤。反应的CRISPR RNA可以被修饰或重新设计，以基于CAS 12a检测靶向其他DNA病毒。该方法有助于对目标病毒的数量进行初步评估。

基于此，可以采用qPCR等其他方法来获得更准确的病毒载量。该技术为便携式DNA病毒检测提供了初步尝试。对于本议定书中使用的青蛙病毒3，及时发现可以促使采取有效的保护措施，减少养殖业的损失。