Notre protocole introduit un système de détection rapide et très sensible pour le virus de la grenouille 3. De manière significative, cette méthode permet la détection des virus à ADN au point de service, jouant un rôle crucial dans la prévention de l’apparition de maladies pandémiques. Le principal avantage de cette technique réside dans son intégration de la RPA avec le système CRISPR/Cas12a, complétée par un microscope portable basé sur un smartphone et une classification par IA.
Cette intégration améliore considérablement l’efficacité et la précision de la détection tout en réduisant les erreurs attribuées aux facteurs humains. Pour commencer, ajoutez les quatre enzymes RPA clés dans le tampon de réaction. Ajoutez ensuite les apprêts préconçus au mélange.
Mélangez soigneusement le mélange. Ajoutez un microlitre de l’ADN cible obtenu à partir du virus de la grenouille 3 à chaque réaction RPA, et vortex pour bien mélanger. Ensuite, pipetez sept microlitres de chlorure de magnésium de 100 millimolaires pour initier la réaction.
Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour terminer le dosage. Préparez la protéine CAS12a de la bactérie Lachnospiraceae avec l’ARN CRISPR pour former des complexes fonctionnels. Mélangez la protéine bactérienne et 10 tampons de réaction CRISPR/Cas12a.
Ajoutez maintenant une sonde rapporteure d’ADN simple brin nanomolaire de 500 nanomolaires. Ajoutez un microlitre de produit de réaction RPA au mélange de réaction d’ARN CRISPR/Cas12a. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Mesurez les signaux fluorescents à l’aide d’un lecteur de microplaques. Pour la détection avec un microscope sur smartphone, commencez par pipeter le mélange réactionnel préparé sur une lame de verre retraitée. Ensuite, couvrez-le d’une lamelle avant l’incubation.
Placez la lame sur la platine du microscope du smartphone et ajustez la distance focale et la clarté. Capturez une image pour mesurer les signaux fluorescents. Utilisez ImageJ pour mesurer la valeur de gris moyenne de chaque image et l’écart-type de la valeur de gris moyenne dans un groupe de concentration.
Adoptez le modèle d’apprentissage profond AlexNet 33 pour la classification. Utilisez maintenant Python pour remodeler les images d’entrée en 224 par 224 par trois canaux. Enfin, utilisez un réseau de base pré-entraîné avec un ensemble de données ImageNet pour extraire les caractéristiques de l’image.
La sixième paire d’amorces a fourni l’efficacité d’amplification maximale et a été sélectionnée. L’ARN-3 de CRISPR s’est avéré être le plus efficace pour le clivage collatéral. L’utilisation d’un système de détection développé avec des amorces RPA sélectionnées et de l’ARN CRISPR a entraîné des différences significatives entre le FV3 10 aM et le contrôle.
Le point le plus important à retenir est l’étape spécifique de détection CAS 12a. L’ARN CRISPR de la réaction peut être modifié ou reconçu pour cibler d’autres virus à ADN en fonction de la détection CAS 12a. La méthode proposée peut aider à l’évaluation préliminaire de la quantité du virus cible.
Sur cette base, d’autres méthodes comme la qPCR peuvent être utilisées pour obtenir une charge virale plus précise. Cette technique constitue une tentative préliminaire de détection portable des virus à ADN. En ce qui concerne le virus de la grenouille 3 utilisé dans ce protocole, une détection précoce peut entraîner des mesures de protection efficaces, réduisant ainsi les pertes dans l’industrie de l’élevage.
