Unser Protokoll führt ein schnelles und hochempfindliches Nachweissystem für das Froschvirus 3 ein. Bezeichnenderweise ermöglicht diese Methode den Point-of-Care-Nachweis von DNA-Viren und spielt eine entscheidende Rolle bei der Verhinderung des Auftretens pandemischer Krankheiten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Integration von RPA mit dem CRISPR/Cas12a-System, ergänzt durch ein tragbares, Smartphone-basiertes Mikroskop und KI-Klassifizierung.
Diese Integration verbessert die Erkennungseffizienz und -genauigkeit erheblich und reduziert gleichzeitig Fehler, die auf menschliche Faktoren zurückzuführen sind. Fügen Sie zunächst die vier wichtigsten RPA-Enzyme in den Reaktionspuffer hinzu. Geben Sie dann die vorgefertigten Grundierungen zur Mischung.
Die Mischung gründlich einreiben. Geben Sie einen Mikroliter der Ziel-DNA, die aus dem Froschvirus 3 gewonnen wurde, zu jeder RPA-Reaktion und vermischen Sie sich gut. Pipettieren Sie anschließend sieben Mikroliter 100 millimolares Magnesiumchlorid, um die Reaktion zu starten.
Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um den Assay abzuschließen. Bereiten Sie das Bakterium CAS12a-Protein Lachnospiraceae mit CRISPR-RNA vor, um funktionelle Komplexe zu bilden. Mischen Sie das bakterielle Protein und 10 X CRISPR/Cas12a-Reaktionspuffer.
Fügen Sie nun eine 500 nanomolare einzelsträngige DNA-Reportersonde hinzu. Geben Sie einen Mikroliter RPA-Reaktionsprodukt in das CRISPR/Cas12a CRISPR-RNA-Reaktionsgemisch. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.
Messen Sie die Fluoreszenzsignale mit einem Mikroplatten-Reader. Für die Detektion mit einem Smartphone-Mikroskop pipettieren Sie zunächst das vorbereitete Reaktionsgemisch auf einen retreated glass slide. Decken Sie es dann vor der Inkubation mit einem Deckglas ab.
Legen Sie den Objektträger auf den Tisch des Smartphone-Mikroskops und stellen Sie die Brennweite und Klarheit ein. Nehmen Sie ein Bild auf, um die Fluoreszenzsignale zu messen. Verwenden Sie ImageJ, um den mittleren Grauwert jedes Bildes und die Standardabweichung des mittleren Grauwerts in einer Konzentrationsgruppe zu messen.
Übernehmen Sie das Deep-Learning-Modell AlexNet 33 für die Klassifizierung. Verwenden Sie nun Python, um die Eingabebilder auf 224 x 224 x drei Kanäle umzuformen. Verwenden Sie abschließend ein vortrainiertes Backbone-Netzwerk mit ImageNet-Dataset, um Bild-Features zu extrahieren.
Das sechste Paar Primer bot die maximale Amplifikationseffizienz und wurde ausgewählt. CRISPR-RNA-3 erwies sich als am effizientesten für die kollaterale Spaltung. Die Verwendung eines entwickelten Detektionssystems mit ausgewählten RPA-Primern und CRISPR-RNA führte zu signifikanten Unterschieden zwischen 10 aM FV3 und der Kontrolle.
Der wichtigste Punkt, den Sie sich merken sollten, ist der spezifische CAS 12a-Erkennungsschritt. Die CRISPR-RNA der Reaktion kann modifiziert oder umgestaltet werden, um auf andere DNA-Viren abzuzielen, die auf dem CAS 12a-Nachweis basieren. Die vorgeschlagene Methode kann bei der vorläufigen Bewertung der Menge des Zielvirus helfen.
Auf dieser Grundlage können andere Methoden wie die qPCR eingesetzt werden, um eine genauere Viruslast zu erhalten. Diese Technik stellt einen ersten Versuch zum tragbaren Nachweis von DNA-Viren dar. Was das in diesem Protokoll verwendete Froschvirus 3 betrifft, so kann eine rechtzeitige Erkennung wirksame Schutzmaßnahmen nach sich ziehen, um Verluste in der Zuchtindustrie zu reduzieren.
