Nuestro protocolo introduce un sistema de detección rápido y altamente sensible para el virus de la rana 3. Cabe destacar que este método permite la detección de virus de ADN en el punto de atención, lo que desempeña un papel crucial en la prevención de la aparición de enfermedades pandémicas. La principal ventaja de esta técnica radica en su integración de RPA con el sistema CRISPR/Cas12a, complementado con un microscopio portátil basado en un teléfono inteligente y clasificación de IA.
Esta integración mejora significativamente la eficiencia y la precisión de la detección, al tiempo que reduce los errores atribuidos a factores humanos. Para comenzar, agregue las cuatro enzimas RPA clave en el tampón de reacción. A continuación, añada los cebadores prediseñados a la mezcla.
Agita la mezcla a fondo. Agregue un microlitro del ADN objetivo obtenido del virus de la rana 3 a cada reacción de RPA y vórtice para mezclar bien. A continuación, pipetee siete microlitros de cloruro de magnesio de 100 milimolares para iniciar la reacción.
Incube la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos para completar el ensayo. Prepare la proteína CAS12a de la bacteria Lachnospiraceae con ARN CRISPR para formar complejos funcionales. Mezcle la proteína bacteriana y 10 tampones de reacción CRISPR/Cas12a.
Ahora agregue 500 sondas reporteras de ADN monocatenario de 500 nanomolares. Agregue un microlitro de producto de reacción RPA a la mezcla de reacción de ARN CRISPR/Cas12a CRISPR. Incuba la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Mida las señales fluorescentes con un lector de microplacas. Para la detección con un microscopio de teléfono inteligente, primero pipetee la mezcla de reacción preparada en un portaobjetos de vidrio retraído. Luego cúbralo con un cubreobjetos antes de la incubación.
Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio del teléfono inteligente y ajuste la distancia focal y la claridad. Captura una imagen para medir las señales fluorescentes. Utilice ImageJ para medir el valor medio de gris de cada imagen y la desviación estándar del valor medio de gris en un grupo de concentración.
Adopte el modelo de aprendizaje profundo AlexNet 33 para la clasificación. Ahora use Python para cambiar la forma de las imágenes de entrada a 224 por 224 por tres canales. Por último, utilice una red troncal previamente entrenada con un conjunto de datos ImageNet para extraer características de imagen.
El sexto par de cebadores proporcionó la máxima eficiencia de amplificación y se seleccionó. El ARN-3 de CRISPR demostró ser el más eficiente para la escisión colateral. El uso de un sistema de detección desarrollado con cebadores RPA seleccionados y ARN CRISPR dio lugar a diferencias significativas entre 10 aM FV3 y el control.
El punto más importante que hay que recordar es el paso específico de detección de CAS 12a. El ARN CRISPR de la reacción puede modificarse o rediseñarse para dirigirse a otros virus de ADN en función de la detección de CAS 12a. El método propuesto puede ayudar en la evaluación preliminar de la cantidad del virus objetivo.
En base a esto, se pueden emplear otros métodos como la qPCR para obtener una carga viral más precisa. Esta técnica proporciona un intento preliminar hacia la detección portátil de virus de ADN. En cuanto al virus de la rana 3 utilizado en este protocolo, la detección oportuna puede dar lugar a medidas de protección efectivas, reduciendo las pérdidas en la industria de la cría.
