Il nostro protocollo introduce un sistema di rilevamento rapido e altamente sensibile per il virus della rana 3. Significativamente, questo metodo consente il rilevamento point of care dei virus a DNA, svolgendo un ruolo cruciale nella prevenzione dell'insorgenza di malattie pandemiche. Il vantaggio principale di questa tecnica risiede nella sua integrazione dell'RPA con il sistema CRISPR/Cas12a, completato da un microscopio portatile basato su smartphone e dalla classificazione AI.
Questa integrazione migliora significativamente l'efficienza e la precisione del rilevamento, riducendo contemporaneamente gli errori attribuiti a fattori umani. Per iniziare, aggiungi i quattro enzimi RPA chiave nel tampone di reazione. Quindi aggiungere i primer predefiniti alla miscela.
Agitare accuratamente la miscela. Aggiungi un microlitro del DNA bersaglio ottenuto dal virus della rana 3 a ciascuna reazione RPA e vortice per mescolare bene. Quindi, pipettare sette microlitri di cloruro di magnesio da 100 millimolari per avviare la reazione.
Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti per completare il saggio. Preparare la proteina CAS12a del batterio delle Lachnospiraceae con l'RNA CRISPR per formare complessi funzionali. Mescolare la proteina batterica e 10 tamponi di reazione CRISPR/Cas12a.
Ora aggiungi una sonda reporter di DNA a filamento singolo nanomolare da 500 nanomolari. Aggiungere un microlitro di prodotto di reazione RPA alla miscela di reazione RNA CRISPR/CRISPR CRISPR/Cas12a. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Misurare i segnali fluorescenti con un lettore di micropiastre. Per il rilevamento con un microscopio per smartphone, pipettare prima la miscela di reazione preparata su un vetrino ritirato. Quindi coprilo con un vetrino coprioggetti prima dell'incubazione.
Posiziona il vetrino sul tavolino del microscopio dello smartphone e regola la lunghezza focale e la chiarezza. Cattura un'immagine per misurare i segnali fluorescenti. Utilizzare ImageJ per misurare il valore medio di grigio di ogni immagine e la deviazione standard del valore medio di grigio in un gruppo di concentrazione.
Adotta il modello di deep learning AlexNet 33 per la classificazione. Ora usa Python per rimodellare le immagini di input a 224 per 224 da tre canali. Infine, utilizza una rete backbone pre-addestrata con il set di dati ImageNet per estrarre le caratteristiche dell'immagine.
La sesta coppia di primer ha fornito la massima efficienza di amplificazione e sono stati selezionati. CRISPR RNA-3 si è dimostrato il più efficiente per la scissione collaterale. L'uso di un sistema di rilevamento sviluppato con primer RPA selezionati e RNA CRISPR ha portato a differenze significative tra 10 aM FV3 e controllo.
Il punto più importante da ricordare è la fase di rilevamento CAS 12a specifica. L'RNA CRISPR della reazione può essere modificato o riprogettato per colpire altri virus a DNA in base al rilevamento CAS 12a. Il metodo proposto può aiutare nella valutazione preliminare della quantità del virus bersaglio.
Sulla base di ciò, è possibile utilizzare altri metodi come la qPCR per ottenere una carica virale più accurata. Questa tecnica fornisce un tentativo preliminare verso il rilevamento portatile dei virus a DNA. Per quanto riguarda il virus della rana 3 utilizzato in questo protocollo, il rilevamento tempestivo può richiedere misure protettive efficaci, riducendo le perdite nell'industria dell'allevamento.
