מערכת זיהוי וירוסי DNA מבוססת על RPA-CRISPR/Cas12A-SPM ולמידה עמוקה

הפרוטוקול שלנו מציג מערכת זיהוי מהירה ורגישה ביותר לנגיף צפרדע 3. באופן משמעותי, שיטה זו מאפשרת זיהוי נקודתי של נגיפי DNA, הממלאים תפקיד מכריע במניעת הופעתן של מחלות פנדמיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו טמון בשילוב של RPA עם מערכת CRISPR/Cas12a, בתוספת מיקרוסקופ נייד מבוסס סמארטפון וסיווג AI.

שילוב זה משפר באופן משמעותי את יעילות הזיהוי והדיוק ובו זמנית מפחית טעויות המיוחסות לגורמים אנושיים. כדי להתחיל, הוסף את ארבעת אנזימי RPA העיקריים במאגר התגובה. לאחר מכן הוסיפו לתערובת את הפריימרים המעוצבים מראש.

מערבבים היטב את התערובת. הוסיפו מיקרוליטר אחד של דנ"א המטרה המתקבל מווירוס צפרדע 3 לכל תגובת RPA, ומערבלים כדי להתערבב היטב. לאחר מכן, פיפטה שבעה מיקרוליטר של 100 מילימולר מגנזיום כלורי כדי ליזום את התגובה.

לדגור על התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להשלים את הבדיקה. הכינו את החיידק Lachnospiraceae CAS12a חלבון עם CRISPR RNA ליצירת קומפלקסים פונקציונליים. ערבבו את החלבון החיידקי ואת מאגר התגובה 10 X CRISPR/Cas12a.

כעת הוסף 500 ננו-מולרית חד-גדילית גשושית כתב DNA. הוסף מיקרוליטר אחד של מוצר תגובת RPA לתערובת תגובת CRISPR/Cas12a CRISPR RNA. דוגרים על התערובת בחום של 37 מעלות למשך 30 דקות.

מדוד את האותות הפלואורסצנטיים באמצעות קורא מיקרו-לוחות. לזיהוי באמצעות מיקרוסקופ סמארטפון, ראשית, יש לדחוס את תערובת התגובה המוכנה על מגלשת זכוכית נסוגה. לאחר מכן מכסים אותו בכיסוי לפני הדגירה.

מקם את השקופית על במת המיקרוסקופ של הטלפון החכם, וכוונן את אורך המוקד והבהירות. צלם תמונה כדי למדוד את האותות הפלואורסצנטיים. השתמשו ב- ImageJ כדי למדוד את הערך האפור הממוצע של כל תמונה ואת סטיית התקן של הערך האפור הממוצע בקבוצת ריכוז.

אמצו את מודל הלמידה העמוקה AlexNet 33 לסיווג. כעת השתמש ב- Python כדי לעצב מחדש את תמונות הקלט ל- 224 על 224 על ידי שלושה ערוצים. לבסוף, השתמש ברשת עמוד שדרה מאומנת מראש עם ערכת נתונים של ImageNet כדי לחלץ תכונות תמונה.

זוג הפריימרים השישי סיפק את יעילות ההגברה המרבית, ונבחרו. CRISPR RNA-3 התגלה כיעיל ביותר עבור מחשוף בטחוני. השימוש במערכת זיהוי מפותחת עם פריימרים נבחרים של RPA ו-CRISPR RNA הביא להבדלים משמעותיים בין FV3 של 10 aM לבין הבקרה.

הנקודה החשובה ביותר שיש לזכור היא שלב זיהוי CAS 12a הספציפי. ניתן לשנות או לעצב מחדש את ה-CRISPR RNA של התגובה כך שתתמקד בנגיפי DNA אחרים בהתבסס על זיהוי CAS 12a. השיטה המוצעת יכולה לסייע בהערכה ראשונית של כמות נגיף היעד.

בהתבסס על כך, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו qPCR כדי להשיג עומס נגיפי מדויק יותר. טכניקה זו מספקת ניסיון ראשוני לקראת זיהוי נייד של נגיפי DNA. באשר וירוס צפרדע 3 המשמש בפרוטוקול זה, זיהוי בזמן יכול להניע אמצעי הגנה יעילים, הפחתת הפסדים בתעשיית הרבייה.