FDA科学与工程实验室办公室正在开发监管科学工具，以协助医疗器械开发商和FDA审查人员。我们的最终目标是通过最好的可用科学加速患者获得创新、安全和有效的医疗设备。在该协议中，我们将尖端的诱导多能干细胞技术应用于评估用于治疗危及生命的心脏病的医疗设备。
这个简单的工具可以使用标准实验室设备对培养皿中的心脏电生理学设备进行可重复的评估。它也可以与来自患有各种心脏病的供体的患者特异性细胞一起使用。首先，将解冻的人iPSC来源的心肌细胞接种在0.1%明胶包被的无菌六孔板上至少两天，然后将心肌细胞接种在柔性水凝胶底物上。
将人iPSC来源的心肌细胞在标准心肌细胞培养基中在37摄氏度和5%二氧化碳下培养2至4天，以使其从冷冻保存中恢复。每 48 小时用 100% 心肌细胞培养基刷新用过的培养基。通过评估细胞的健康状况，在解离之前检查人iPSC来源的心肌细胞的状态，确保活力和稳定的跳动。
用每孔四毫升不含氯化钙或氯化镁的DPBS洗涤心肌细胞。向每个孔中加入一毫升室温解离试剂，并在37摄氏度下孵育15分钟。接下来，将10毫升心肌细胞培养基加入无菌的15毫升锥形管中。
用1， 000微升移液管将心肌细胞从六孔板中解离，并将细胞悬液添加到锥形管中。用一毫升新鲜心肌细胞培养基冲洗孔，以收集任何残留的心肌细胞并将它们添加到锥形管中。然后用培养基将锥形管的最终体积降至 15 毫升。
将管以200 G离心五分钟，然后除去上清液至1毫升标记。将心肌细胞培养基中的细胞重悬至终体积为5毫升，并用手动或自动细胞计数器计数心肌细胞。接下来，在制备柔性水凝胶底物的同时，在室温下孵育心肌细胞悬液约30分钟。
在组织培养罩中准备一个 20 微升移液器套件、移液器吸头、无菌 48 孔玻璃底板和秒表计时器。通过轻轻敲击试管并立即将其放回冰上来混合细胞外基质或基于 ECM 的水凝胶底物。在电镀第一个水凝胶基材之前立即启动秒表计时器，并将其标记为零时间。
上下移取一微升水凝胶底物约三次，以冷却移液器吸头。然后将约一微升未稀释的水凝胶底物水平施涂在48孔板中每个孔的底部，将移液器保持在45度角。在每个孔中以相同的方向接种所有水凝胶底物，以帮助在以40X放大倍率进行实验时识别底物。
将盖子放在48孔板上，让水凝胶底物在室温下在组织培养罩中孵育8至10分钟，然后再添加细胞。孵育后，立即将心肌细胞直接滴入水凝胶底物上，每孔约30， 000个活心肌细胞，在约200微升心肌细胞培养基的低培养基体积中。盖上盖子后，让心肌细胞在室温下在罩中不受干扰地孵育10至15分钟，以使细胞粘附在水凝胶底物上。
向每个孔中轻轻加入100微升新鲜心肌细胞培养基。将盖子封闭的板放在37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱上两到四天。打开显微镜和环境控制室，使其平衡至37摄氏度和5%二氧化碳。
从48孔板中取出心肌细胞培养基，并用600微升心脏收缩力调节或CCM测定培养基轻轻冲洗每个孔两次。然后每孔加入300微升CCM测定培养基，并将48孔板放在环境控制室的显微镜上。插入电极并平衡电池五分钟。
要使用基于视频的显微镜录制收缩视频，请打开视频录制软件并将帧速率设置为每秒 100 帧。然后选择 hiPSC-CM 单层中心附近的感兴趣区域或 ROI。然后用商用脉冲发生器对细胞进行场刺激，以电起搏2D心肌细胞单层。
将心肌细胞置于具有基线脉冲参数的一赫兹阈值的 1.5 倍。例如，单相方波起搏脉冲具有两毫秒刺激脉冲持续时间为五伏。在 CCM 之前录制基线起搏仅收缩视频，至少 5 次。
然后用30毫秒延迟的实验电信号，两个对称的双相脉冲以5.14毫秒的相位持续时间，以20.56毫秒的总持续时间，10伏的相位幅度和零相间间隔刺激心肌细胞单层。录制CCM诱导的收缩视频至少五拍。关闭CCM信号，用基线起搏脉冲刺激，并录制CCM后恢复期的收缩视频，至少五次。
使用标准收缩软件自动分析收缩视频，量化收缩幅度、收缩斜率、松弛斜率、峰值时间、基线时间90%和收缩持续时间50%等关键收缩特性，表征2D人iPSC来源的心肌细胞单层收缩特性，量化心肌细胞收缩力的关键参数。标准CCM刺激参数的应用增强了体外收缩性能。评估细胞外钙浓度调节在有和没有CCM刺激的情况下对人体收缩性能的影响。
观察到收缩的预期基线钙依赖性，以及CCM诱导的心肌细胞单层水平钙敏感性增加。此外，对β雄激素信号通路的药理学询问表明，CCM诱导的正性肌力作用部分是由β肾上腺素能信号介导的。此外，该工具可以扩展到患者特异性疾病心肌细胞，包括扩张型心肌病的心肌细胞，以了解CCM在疾病状态背景下的影响。
在这里，我们主要关注评估人类的收缩特性。然而，使用此工具，还可以评估其他心脏兴奋性收缩耦合读数，包括动作电位和钙处理。这是第一个通过技术将诱导多能干细胞与心脏设备评估相结合的监管科学工具。
这种替代方法为在培养皿中评估医疗设备铺平了道路，并有可能减少对动物和人类受试者测试的需求。
