使用全内反射荧光（TIRF）显微镜对脂质双层中的横向迁移率和离子通道活性进行单分子成像

离子通道在生物膜中不是静态的。在这里，我们提出了一种单分子光学方法来揭示侧向膜扩散与离子通道功能之间的联系。与其他方法相比，该技术的主要优点是不需要对可能干扰其横向运动和功能的蛋白质进行荧光标记。

该方法可应用于任何膜蛋白通道，其中自由或限制扩散对组织和功能很重要。首先，将380微升DPhPC储备溶液转移到玻璃小瓶中，并用氩气或氮气覆盖脂质储备溶液以防止脂质氧化。使用尽可能低的气流，以避免溶解脂质的有机溶剂蒸发，或溶剂从小瓶中喷出。

在氮气流下干燥脂质样品，并使用无油真空泵在真空下从脂质样品中除去剩余的有机溶剂过夜。使用一毫升移液管加入等体积的十六烷和硅油，使脂质膜溶解在十六烷硅油溶液中，最终脂质浓度为每毫升9.5毫克。将一些玻璃盖玻片放入不锈钢盖玻片支架中，并在玻璃烧杯中用超声波清洁器中的丙酮清洁约 10 分钟。

用双去离子水冲洗盖玻片，并在氮气流下干燥。此外，在等离子清洁器中用氧气清洁和水化盖玻片五分钟。将等离子体处理的盖玻片安装在旋涂机上，并通过用200微升移液管以3， 000 RPM缓慢加入140微升加热的0.75%低熔点琼脂糖膜，在盖玻片上涂覆亚微米厚的琼脂糖膜30秒。

立即将带有琼脂糖水凝胶薄层的旋涂盖玻片连接到PMMA室的下侧。确保琼脂糖水凝胶指向上方。用透明胶带将盖玻片的边缘固定在PMMA微加工设备上，并将设备放在加热到35摄氏度的热板上。

小心地将200微升2.5%琼脂糖溶液倒入腔室入口中，不要产生气泡。立即用约60微升的脂质油溶液覆盖PMMA室的孔，以在琼脂糖油界面处启动脂质单层形成，以避免PMMA室孔中的旋涂琼脂糖脱水。将设备放在 35 摄氏度的热板上约 2 小时。

将约20微升脂质十六烷硅油溶液放入液滴孵育室的几个微制孔中。使用垂直或水平微量移液器拉拔器制备尖端开口直径约为20微米的微毛细管玻璃针。用大约5微升含有8.8毫摩尔HEPES，7微摩尔荧光染料，Fluo-8，400微摩尔EDTA，1.32摩尔氯化钾和30纳摩尔TOM核心复合物的水性注射溶液填充针头或替代20纳摩尔OMPF。

将带有水性注射溶液的针头安装在压电驱动的纳米注射器上，并使用纳米注射器将100至200纳升水滴注入液滴孵育室中的孔中，液滴充满脂质十六烷硅油溶液。通过将PMMA和液滴孵育室保持在加热至35摄氏度的热板上，允许在液滴油界面形成脂质单层约两个小时。使用带有10微升一次性聚丙烯吸头的单通道微升移液管手动将单个水滴从液滴孵育室的孔转移到PMMA室的孔中。

允许液滴在水凝胶 - 油界面处沉入脂质单层，在液滴和琼脂糖水凝胶之间形成脂质双层。将带有液滴界面双层或DIB膜的PMMA室安装在倒置光学显微镜的样品架上，并使用10倍霍夫曼调制造影镜评估膜的形成。如果已形成DIB膜，则将PMMA室安装在TIRF显微镜的样品架上，该显微镜配备用于落射荧光照明的传统光源，488纳米激光器和背照式电子倍增CCD相机，以实现约0.16微米的像素尺寸。

使用GFP滤光片组，在落射荧光照明下，使用高强度光源，用10倍放大镜聚焦DIB膜的边缘。使用100x NA 1.49复消色差油TIRF物镜在高倍率下精细聚焦DIB膜的同一边缘，再次使用GFP滤光片组在高强度光源的落射荧光照明下。将滤光片设置从GFP更改为四波段TIRF滤光片组，打开488纳米激光器，并在物镜上设置激光强度。

要可视化单个离子通道，请调整TIRF角度和EM CCD相机增益，使DIB膜中的开放离子通道在深色背景上显示为高对比度荧光斑点，并且信噪比达到最大值。确保通过单离子通道的钙离子通量对应的斑点保持聚焦，并具有圆形，中心强度高，并向外围逐渐减小。检查荧光斑点是否聚焦，以确保离子通道已重组到DIB膜中并在膜平面中横向移动。

最后，记录一系列膜图像，以便正确跟踪位置并监测各个离子通道的开闭状态。要确定横向移动的类型和通道活动的状态，请获取足够长且采样良好的轨迹。这里显示了神经孢子虫TOM-CC的冷冻电镜结构。

将含有TOM 22和6-His标签的N.crassa染色剂的线粒体溶解在DDM中，并进行镍NTA亲和色谱和阴离子交换色谱。此处显示了分离的TOM-CC晶体结构的SDS-PAGE和用于比较的纯化大肠杆菌OMPF的SDS-PAGE。TOM-CC相应轨迹中的荧光幅度轨迹表明，TOM-CC的开闭通道活性与复合物的侧膜迁移率相关。

幅值轨迹显示三种渗透率状态:运动通道对应的全开状态、中间渗透率状态和非移动通道对应的闭合通道状态。处于中间状态的TOM-CC在其平均位置周围摆动约正负60纳米。此处显示了OMPF相应轨迹中的荧光幅度轨迹。

与TOM-CC相比，OMPF仅显示一个强度级别，无论它是在运动中还是被捕获。与捕获分子的时间段相对应的轨迹段标记为灰色。需要注意的重要一点是，该方法在完整的膜环境中分析单个膜蛋白。

在可预见的未来，膜蛋白的动力学仍将是科学研究的地平线。我们希望我们的方法能够为这一领域做出重大贡献。