Ionenkanäle sind in biologischen Membranen nicht statisch. In dieser Arbeit stellen wir einen optischen Einzelmolekül-Ansatz vor, um die Verbindung zwischen lateraler Membrandiffusion und Ionenkanalfunktion zu entschlüsseln. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden besteht darin, dass eine Fluoreszenzmarkierung von Proteinen, die ihre laterale Bewegung und Funktion beeinträchtigen könnten, nicht erforderlich ist.
Die Methode kann auf jeden Membranproteinkanal angewendet werden, bei dem freie oder eingeschränkte Diffusion für Organisation und Funktion wichtig ist. Füllen Sie zunächst 380 Mikroliter der DPhPC-Stammlösung in eine Glasdurchstechflasche und überlagern Sie die Lipidlösung mit Argon oder Stickstoffgas, um eine Lipidoxidation zu verhindern. Verwenden Sie einen möglichst geringen Gasstrom, um ein Verdampfen des organischen Lösungsmittels, in dem die Lipide gelöst sind, oder ein Spritzen der Lösungsmittelsprays aus der Durchstechflasche zu vermeiden.
Trocknen Sie die Lipidprobe unter einem Stickstoffstrom und entfernen Sie das verbleibende organische Lösungsmittel unter Vakuum mit einer ölfreien Vakuumpumpe über Nacht. Lösen Sie den Lipidfilm in einer Hexadecan-Silikonöllösung auf, indem Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette gleiche Mengen Hexadecan- und Silikonöl zu einer endgültigen Lipidkonzentration von 9,5 Milligramm pro Milliliter hinzufügen. Legen Sie einige Glasdeckgläser in einen Deckglashalter aus Edelstahl und reinigen Sie sie in einem Glasbecher ca. 10 Minuten lang mit Aceton in einem Ultraschallreiniger.
Spülen Sie die Deckgläser mit doppelt deionisiertem Wasser ab und trocknen Sie sie unter einem Stickstoffstrahl. Reinigen und hydrophylieren Sie außerdem ein Deckglas fünf Minuten lang in einem Plasmareiniger mit Sauerstoff. Montieren Sie ein plasmabehandeltes Deckglas auf einem Spin Coater und beschichten Sie das Deckglas mit einem Submikrometer dicken Agarosefilm, indem Sie langsam 140 Mikroliter erhitzte 0,75 % niedrigschmelzende Agarose mit einer 200-Mikroliter-Pipette bei 3.000 U/min für 30 Sekunden hinzufügen.
Befestigen Sie das schleuderbeschichtete Deckglas mit der dünnen Schicht des Agarose-Hydrogels sofort an der Unterseite der PMMA-Kammer. Achten Sie darauf, dass das Agarose-Hydrogel nach oben zeigt. Befestigen Sie die Kanten des Deckglases mit transparentem Klebeband an der mikrobearbeiteten PMMA-Vorrichtung und legen Sie das Gerät auf eine auf 35 Grad Celsius erhitzte Heizplatte.
Gießen Sie vorsichtig 200 Mikroliter 2,5%ige Agaroselösung in den Einlass der Kammer, ohne Luftblasen zu erzeugen. Decken Sie die Vertiefungen der PMMA-Kammer sofort mit etwa 60 Mikrolitern der Lipidöllösung ab, um die Bildung von Lipid-Monolagen an der Agaroseöl-Grenzfläche einzuleiten und ein Austrocknen der spinbeschichteten Agarose in den Vertiefungen der PMMA-Kammer zu vermeiden. Stellen Sie das Gerät für etwa zwei Stunden auf eine Kochplatte bei 35 Grad Celsius.
Geben Sie etwa 20 Mikroliter Lipid-Hexadecan-Silikonöllösung in jede der mehreren mikrofabrizierten Vertiefungen in einer Tröpfchen-Inkubationskammer. Eine Mikrokapillarglasnadel mit einem Spitzenöffnungsdurchmesser von ca. 20 Mikrometern wird mit einem vertikalen oder horizontalen Mikropipettenzieher präpariert. Füllen Sie die Nadel mit etwa fünf Mikrolitern wässriger Injektionslösung, die 8,8 millimolare HEPES, sieben Mikromolare eines Fluoreszenzfarbstoffs, Fluo-8, 400 mikromolare EDTA, 1,32 molaren Kaliumchlorid- und 30 nanomolaren TOM-Kernkomplex oder alternativ 20 nanomolare OMPF enthält.
Montieren Sie die Nadel mit der wässrigen Injektionslösung auf einen piezogetriebenen Nanoinjektor und injizieren Sie mit dem Nanoinjektor 100 bis 200 Nanoliter wässrige Tröpfchen in die Vertiefungen in der mit Lipidhexadecan-Silikonöllösung gefüllten Tröpfcheninkubationskammer. Lassen Sie die Bildung einer Lipidmonoschicht an der Grenzfläche des Tröpfchenöls etwa zwei Stunden lang zu, indem Sie die PMMA- und Tröpfcheninkubationskammern auf einer auf 35 Grad Celsius erhitzten Heizplatte warten. Übertragen Sie einzelne wässrige Tröpfchen manuell aus den Vertiefungen der Tröpfcheninkubationskammer in die Vertiefungen der PMMA-Kammer mit einer Einkanal-Mikroliterpipette mit einer 10-Mikroliter-Einwegspitze aus Polypropylen.
Lassen Sie die Tröpfchen auf die Lipidmonoschichten an den Hydrogel-Öl-Grenzflächen sinken, um eine Lipiddoppelschicht zwischen den Tröpfchen und dem Agarose-Hydrogel zu bilden. Montieren Sie die PMMA-Kammer mit der Tröpfchenschnittstellendoppelschicht oder DIB-Membranen auf dem Probenhalter eines Inverslichtmikroskops und beurteilen Sie die Membranbildung mit einem 10-fachen Hoffman-Modulationskontrastobjektiv. Wenn sich DIB-Membranen gebildet haben, montieren Sie die PMMA-Kammer auf dem Probenhalter eines TIRF-Mikroskops, das mit einer konventionellen Lichtquelle für die Epifluoreszenzbeleuchtung, einem 488-Nanometer-Laser und einer rückwärtig belichteten Elektronenmultiplizierungs-CCD-Kamera ausgestattet ist, um eine Pixelgröße von etwa 0,16 Mikrometern zu erreichen.
Fokussieren Sie den Rand einer DIB-Membran mit einem Objektiv mit 10-facher Vergrößerung unter Epifluoreszenzbeleuchtung mit einer hochintensiven Lichtquelle unter Verwendung eines GFP-Filtersets. Fokussieren Sie den gleichen Rand der DIB-Membran bei hoher Vergrößerung mit einem 100-fachen NA 1,49 apochromatischen Öl-TIRF-Objektiv, ebenfalls unter Epifluoreszenzbeleuchtung mit einer hochintensiven Lichtquelle unter Verwendung eines GFP-Filtersets. Ändern Sie die Filtereinstellung von GFP auf das Quadband-TIRF-Filterset, schalten Sie den 488-Nanometer-Laser ein und stellen Sie die Intensität des Lasers auf der Objektivlinse ein.
Um einzelne Ionenkanäle sichtbar zu machen, stellen Sie den TIRF-Winkel und die Verstärkung der EM-CCD-Kamera so ein, dass die offenen Ionenkanäle in der DIB-Membran als kontrastreiche Fluoreszenzflecken auf dunklem Hintergrund erscheinen und das Signal-Hintergrund-Verhältnis ein Maximum erreicht. Stellen Sie sicher, dass die Flecken, die dem Kalziumionenfluss durch einzelne Ionenkanäle entsprechen, scharf bleiben und eine runde Form mit hoher Intensität in der Mitte haben, die zur Peripherie hin allmählich abnimmt. Überprüfen Sie, ob die fluoreszierenden Punkte scharf sind, um sicherzustellen, dass sich die Ionenkanäle in den DIB-Membranen rekonstituiert haben und sich seitlich in der Membranebene bewegen.
Zeichnen Sie schließlich eine Reihe von Membranbildern auf, die eine ordnungsgemäße Verfolgung der Position und die Überwachung des offen-geschlossenen Zustands der einzelnen Ionenkanäle ermöglichen. Um die Art der lateralen Beweglichkeit und den Zustand der Kanalaktivität zu bestimmen, erfassen Sie ausreichend lange und gut abgetastete Trajektorien. Die Kryo-EM-Struktur von Neurospora crassa TOM-CC ist hier dargestellt.
Mitochondrien aus einer N.crassa-Färbung, die ein TOM 22 mit einem 6-His-Tag enthielt, wurden in DDM solubilisiert und einer Nickel-NTA-Affinitätschromatographie und Anionenaustauschchromatographie unterzogen. Die SDS-PAGE der isolierten TOM-CC-Kristallstruktur und die SDS-PAGE des gereinigten E.coli OMPF, die zum Vergleich verwendet werden, sind hier dargestellt. Die fluoreszierende Amplitudenspur in der entsprechenden Trajektorie von TOM-CC deutet darauf hin, dass die Aktivität des offen-geschlossenen Kanals von TOM-CC mit der lateralen Membranbeweglichkeit des Komplexes korreliert.
Die Amplitudenkurve zeigt drei Permeabilitätszustände an: vollständig geöffneter Zustand, der bewegten Kanälen entspricht, mittlerer Permeabilitätszustand, und geschlossener Kanalzustand, der nicht beweglichen Kanälen entspricht. TOM-CC wackelt im Zwischenzustand um etwa plus/minus 60 Nanometer um seine mittlere Position. Die Fluoreszenzamplitudenspur in der entsprechenden Trajektorie von OMPF sind hier dargestellt.
OMPF zeigt im Vergleich zu TOM-CC nur eine Intensitätsstufe an, unabhängig davon, ob es sich in Bewegung oder gefangen befindet. Die Trajektoriensegmente, die den Zeitperioden der gefangenen Moleküle entsprechen, sind grau markiert. Wichtig ist, dass bei dieser Methode einzelne Membranproteine in einer intakten Membranumgebung analysiert werden.
Die Dynamik von Membranproteinen wird auf absehbare Zeit ein Horizont für wissenschaftliche Untersuchungen bleiben. Wir erwarten, dass unsere Methode einen wesentlichen Beitrag zu diesem Bereich leisten wird.
