Os canais iônicos não são estáticos nas membranas biológicas. Aqui apresentamos uma abordagem óptica de molécula única para desvendar a ligação entre a difusão da membrana lateral e a função do canal iônico. A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos é que a marcação fluorescente de proteínas que possam interferir com seu movimento lateral e função não é necessária.
O método pode ser aplicado a qualquer canal de proteína de membrana onde a difusão livre ou restrita é importante para a organização e função. Para começar, transfira 380 microlitros da solução estoque de DPhPC para um frasco de vidro e sobreponha a solução de estoque lipídico com argônio ou gás nitrogênio para evitar a oxidação lipídica. Use o menor fluxo de gás possível para evitar a evaporação do solvente orgânico no qual os lipídios são dissolvidos ou respingos dos sprays de solvente do frasco para injetáveis.
Secar a amostra lipídica sob uma corrente de nitrogênio e remover o solvente orgânico restante da amostra lipídica sob vácuo usando uma bomba de vácuo isenta de óleo durante a noite. Dissolva o filme lipídico em uma solução de óleo de silicone hexadecano adicionando volumes iguais de hexadecano e óleo de silicone usando uma pipeta de um mililitro para uma concentração lipídica final de 9,5 miligramas por mililitro. Coloque algumas tampas de vidro em um suporte de deslizamento de aço inoxidável e limpe-as em um copo de vidro por cerca de 10 minutos com acetona em um limpador ultrassônico.
Enxágue as lamínulas com água duplamente deionizada e seque-as sob uma corrente de nitrogênio. Além disso, limpe e hidrofilize uma tampa em um limpador de plasma com oxigênio por cinco minutos. Monte uma lamínula tratada com plasma em um revestidor de spin e cubra a lamínula com uma película de agarose de espessura sub-micrômetro adicionando lentamente 140 microlitros de agarose aquecida 0,75% de baixa fusão com uma pipeta de 200 microlitros a 3.000 RPM por 30 segundos.
Fixe imediatamente a lamínula revestida por spin com a fina camada do hidrogel de agarose à parte inferior da câmara de PMMA. Certifique-se de que o hidrogel de agarose aponta para cima. Fixe as bordas da tampa no dispositivo microusinado de PMMA com fita adesiva transparente e coloque o dispositivo em uma placa quente aquecida a 35 graus Celsius.
Despeje cuidadosamente 200 microlitros de solução de agarose a 2,5% na entrada da câmara sem criar bolhas de ar. Cobrir imediatamente os poços da câmara de PMMA com cerca de 60 microlitros da solução de óleo lipídico para iniciar a formação de monocamada lipídica na interface óleo de agarose para evitar a desidratação da agarose revestida por spin nos poços da câmara de PMMA. Coloque o dispositivo em uma placa quente a 35 graus Celsius por cerca de duas horas.
Coloque cerca de 20 microlitros de solução de óleo de silicone hexadecano lipídico em cada um dos vários poços microfabricados em uma câmara de incubação de gotículas. Prepare uma agulha de vidro microcapilar com um diâmetro de abertura da ponta de cerca de 20 micrômetros usando um puxador de micropipeta vertical ou horizontal. Encher a agulha com cerca de cinco microlitros de solução aquosa de injeção contendo 8,8 milimolares de HEPES, sete micromolares de um corante fluorescente, Fluo-8, 400 EDTA micromolares, cloreto de potássio 1,32 molar e complexo de núcleo TOM nanomolar 30 ou, alternativamente, 20 OMPF nanomolares.
Monte a agulha com a solução de injeção aquosa em um nanoinjetor piezo-acionado e injete 100 a 200 nanolitros de gotículas aquosas nos poços na câmara de incubação de gotículas preenchida com solução de óleo de silicone hexadecano lipídico usando o nanoinjetor. Permitir a formação de uma monocamada lipídica na interface óleo de gotícula por cerca de duas horas, mantendo as câmaras de incubação de PMMA e gotículas em uma placa quente aquecida a 35 graus Celsius. Transfira manualmente gotículas aquosas individuais dos poços da câmara de incubação de gotículas para os poços da câmara de PMMA usando uma pipeta de microlitro de canal único com uma ponta de polipropileno descartável de 10 microlitros.
Deixe as gotículas afundarem nas monocamadas lipídicas nas interfaces hidrogel-óleo para formar uma bicamada lipídica entre as gotículas e o hidrogel de agarose. Monte a câmara de PMMA com as membranas de bicamada ou DIB de interface de gotículas no porta-amostra de um microscópio de luz invertida e avalie a formação da membrana usando uma objetiva de contraste de modulação Hoffman de 10x. Se as membranas DIB se formaram, monte a câmara de PMMA no porta-amostras de um microscópio TIRF equipado com uma fonte de luz convencional para iluminação de epifluorescência, um laser de 488 nanômetros e uma câmera CCD multiplicadora de elétrons retroiluminados para atingir um tamanho de pixel de cerca de 0,16 micrômetros.
Focalize a borda de uma membrana DIB com uma objetiva de aumento de 10x sob iluminação de epifluorescência com uma fonte de luz de alta intensidade usando um conjunto de filtros GFP. Focalize fino a mesma borda da membrana DIB em alta magnificação com uma objetiva TIRF de óleo apocromático 100x NA 1,49, novamente sob iluminação de epifluorescência com uma fonte de luz de alta intensidade usando um conjunto de filtros GFP. Altere a configuração do filtro de GFP para o conjunto de filtros TIRF quad band, ligue o laser de 488 nanômetros e defina a intensidade do laser na lente objetiva.
Para visualizar canais de íons únicos, ajuste o ângulo TIRF e o ganho da câmera EM CCD para que os canais de íons abertos na membrana DIB apareçam como pontos fluorescentes de alto contraste em um fundo escuro, e a relação sinal/fundo atinja um máximo. Certifique-se de que os pontos correspondentes ao fluxo de íons cálcio através de canais iônicos únicos permaneçam em foco e tenham uma forma redonda com alta intensidade no centro e diminuindo gradualmente em direção à periferia. Verifique se os pontos fluorescentes estão em foco para garantir que os canais iônicos se reconstituíram nas membranas DIB e estão se movendo lateralmente no plano da membrana.
Finalmente, registre uma série de imagens de membrana que permitam o rastreamento adequado da posição e o monitoramento do estado aberto-fechado dos canais iônicos individuais. Para determinar o tipo de mobilidade lateral e o estado de atividade do canal, adquira trajetórias suficientemente longas e bem amostradas. A estrutura Cryo EM de Neurospora crassa TOM-CC é mostrada aqui.
Mitocôndrias de uma coloração de N.crassa contendo um TOM 22 com um tag de 6-His foram solubilizadas em DDM e submetidas à cromatografia de afinidade por níquel NTA e cromatografia de troca aniônica. SDS-PAGE da estrutura cristalina isolada de TOM-CC e SDS-PAGE de E.coli OMPF purificada usados para comparação são mostrados aqui. O traço de amplitude fluorescente na trajetória correspondente do TOM-CC indica que a atividade do canal aberto-fechado do TOM-CC correlaciona-se com a mobilidade da membrana lateral do complexo.
O traço de amplitude exibe três estados de permeabilidade: estado totalmente aberto correspondente a canais móveis, estado de permeabilidade intermediário e estado de canal fechado correspondente a canais não móveis. O TOM-CC no estado intermediário oscila em torno de sua posição média em cerca de 60 nanômetros mais/menos. O traço de amplitude fluorescente na trajetória correspondente do OMPF é mostrado aqui.
O OMPF revela apenas um nível de intensidade em comparação ao TOM-CC, independentemente de estar em movimento ou preso. Os segmentos de trajetória correspondentes aos períodos de tempo das moléculas aprisionadas são marcados em cinza. Uma coisa importante a notar é que este método analisa proteínas de membrana única em um ambiente de membrana intacta.
A dinâmica das proteínas de membrana continuará a ser um horizonte para estudos científicos num futuro próximo. Esperamos que nosso método contribua significativamente para este campo.
