使用脱脂牛奶絮凝和超滤法浓缩环境水和废水样品中的病毒颗粒

水基和废水流行病学已成为监测和预测社区疫情进程的替代方法。脱脂牛奶絮凝法代表了浓缩微生物的另一种方法。脱脂牛奶絮凝法代表了一种多功能、廉价且易于手动操作的方法，用于浓缩微生物组分，与超滤或切向流过滤方法相比没有显着差异。

这种方法用于宏基因组学或靶向PCR研究。一旦微生物组分浓缩，就可以使用商业提取试剂盒或内部方案进行核酸提取。脱脂牛奶絮凝方法对于大体积或少量的水或废水样品相对容易。

此方法应包括使用 Milli-Q 水的背景控制。演示该程序的将是Miguel Uyaguari实验室的研究生Kadir Yanac，Jhannelle Francis和Jocelyn Zambrano-Alvarado。首先，收集两升 24 小时流量比例复合原始废水样品。

将样品装在保温盒中的防光瓶中运送到实验室，并在24小时内进行处理。从污水处理厂技术人员那里获取废水特性数据。对于每种超滤方法，将 10 到 4 个拷贝的铠装 RNA 加标五倍，放入一个日期收集的六个新鲜废水样品和另一个日期收集的六个新鲜废水样品中的 140 毫升中。

通过在磁力搅拌下在 4 摄氏度下搅拌 30 分钟来匀浆样品中的铠装 RNA。对于脱脂牛奶絮凝或SMF，通过将0.5克脱脂奶粉溶解在50毫升合成海水中来制备1%脱脂牛奶溶液。使用一种普通盐酸将SMF的pH值调节至3.5。

将5毫升脱脂牛奶溶液加入500毫升原废水样品中。搅拌样品八小时，让形成的鸡群在室温下再沉降八小时。使用血清移液管去除上清液，而不会干扰沉淀的鸡群。

将含有羊群的50毫升的最终体积转移到离心管中，并在4摄氏度下以8， 000 G离心30分钟。除去上清液，并使用无菌刮刀小心地刮除沉淀。将剩余的沉淀重悬于250微升0.2摩尔磷酸钠缓冲液中。

将刮擦和重悬的颗粒转移到相同的1.5毫升迷你离心管中。根据制造商的说明，使用苯酚与氯仿与异戊醇和β巯基乙醇比例为25：24：2：1的RNA提取试剂盒从废水样品的病毒浓缩物中进行病毒RNA提取和回收效率测定。最后，在50微升洗脱缓冲液中洗脱RNA。

对于 RT-qPCR 分析，使用合成单链 DNA 或 gBlock 构建体的十倍稀释液定量装甲 RNA。获得每次RT-qPCR运行的校准曲线。包括阴性对照并一式三份运行样品。

收集10升环境地表水样本。包括 10 升去离子水用于背景控制。使用0.45、0.2和0.1微米尺寸的膜盘式过滤器进行胶囊和真空过滤，以最大程度地减少宏基因组学测序过程中的噪音。

过滤后，使用一种普通盐酸将水样的pH值调节至3.5。准备1%预絮凝的脱脂牛奶溶液，并将pH值调节至3.5。将100毫升酸化脱脂牛奶溶液加入10升酸化环境水样中。

在室温下在磁摇床上搅拌样品八小时，让鸡群在重力作用下再沉淀八小时。沉淀后，使用真空泵小心地除去上清液，不要打扰羊群。根据重量在50毫升离心管和离心机中分装并平衡剩余的鸡群。

除去上清液并将沉淀溶解在200微升0.2摩尔磷酸钠缓冲液中。按照制造商的说明用 DNase I 和 RNase A 处理溶解的沉淀，以消除提取过程中沉淀的游离 DNA 和 RNA。孵育后，灭活 DNA 酶 I 和 RNase A.使用 DNA 或 RNA 提取试剂盒从溶解的沉淀中提取核酸。

使用荧光计定量从环境地表水样品中提取的DNA或RNA的总量。进行qPCR分析以靶向感兴趣的肠道病毒，并进行Illumina测序以鉴定病毒群落结构。从受保护和受影响的水道中收集两升水样。

如果样品中含有大量碎屑，请使用粗棉布将其清除。将 20 毫升 1% 脱脂牛奶溶液添加到先前 pH 调节的 2 升淡水样品中。在室温下搅拌样品八小时，让鸡群在重力作用下再沉淀八小时。

沉淀后，使用蠕动泵小心地除去上清液。将沉淀的鸡群转移到50毫升离心管中，并在4摄氏度下以8， 000 G离心30分钟。弃去上清液并将沉淀重悬于200微升0.2摩尔磷酸钠缓冲液中。

按照制造商的说明，使用所选的核酸分离试剂盒选择大约 0.5 克的鸡群进行 DNA 提取。使用荧光计测定DNA浓度和纯度。用3， 000 G超滤处理的所有六个样品均呈阳性。

相比之下，当样品以7， 500 G的超滤处理时，只有一个样品呈阳性，所有用SMF处理的样品均为阳性，回收率更高。3， 000 G和SMF的平均回收率显著且始终高于7， 500 G的超滤.这里总结了受影响样品中的水质参数和从温尼伯三个季节收集的环境水样品中提取的核酸。2022 年 4 月至 10 月从阿西尼博因河水中收集的样本从森林 1 中获得了最高的 DNA 浓度，从农业地点 3 中回收的浓度最低。

使用正确浓度的脱脂牛奶并在使用前对样品进行酸化非常重要。该技术可以快速筛选环境样品（如水和废水）中存在的不同微生物病原体。可以使用固体基质（例如土壤或沉积物）进行其他修改。