La epidemiología basada en el agua y las aguas residuales ha surgido como un método alternativo para monitorear y predecir el curso de los brotes en las comunidades. El método de floculación de leche desnatada representa un enfoque alternativo para concentrar microbios. El método de floculación de leche desnatada representa un método versátil, barato y fácil de no intervenir para concentrar fracciones microbianas sin diferencias significativas en comparación con los enfoques de ultrafiltración o filtración de flujo tangencial.
Este enfoque se utiliza para estudios metagenómicos o de PCR dirigida. Una vez que se concentran las fracciones microbianas, la extracción de ácidos nucleicos se puede realizar utilizando kits de extracción comerciales o un protocolo interno. El método de floculación de leche desnatada es relativamente más fácil para volúmenes grandes o pequeños de muestras de agua o aguas residuales.
Se debe incluir un control de fondo con agua Milli-Q como parte de este método. Demostrando el procedimiento estarán Kadir Yanac, Jhannelle Francis y Jocelyn Zambrano-Alvarado, estudiantes graduados del laboratorio de Miguel Uyaguari. Para comenzar, recoja dos litros de muestras de aguas residuales compuestas compuestas proporcionales de flujo de 24 horas.
Transporte las muestras al laboratorio en botellas a prueba de luz en una nevera y procesarlas en 24 horas. Obtenga los datos de características de las aguas residuales del personal técnico de la planta de tratamiento de aguas residuales. Para cada método de ultrafiltración, aumente cinco veces 10 a la cuarta copia de ARN blindado en 140 mililitros de cada una de las seis muestras de aguas residuales frescas recolectadas en una fecha y seis muestras de aguas residuales frescas en otra fecha.
Homogeneice el ARN blindado en la muestra agitando durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en una agitación magnética. Para la floculación de leche desnatada o SMF, prepare una solución de leche desnatada al 1% disolviendo 0,5 gramos de leche desnatada en polvo en 50 mililitros de agua de mar sintética. Ajuste el pH de SMF a 3.5 usando un ácido clorhídrico normal.
Agregue cinco mililitros de solución de leche desnatada a 500 mililitros de muestra de aguas residuales crudas. Revuelva la muestra durante ocho horas y deje que las parvadas formadas se asienten durante otras ocho horas a temperatura ambiente. Retirar el sobrenadante con una pipeta serológica sin molestar a las parvadas asentadas.
Transfiera un volumen final de 50 mililitros que contenga las bandadas a un tubo de centrífuga y centrifugar a 8, 000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y deseche cuidadosamente el pellet con una espátula esterilizada. Resuspender el pellet restante en 250 microlitros de tampón fosfato de sodio 0,2 molar.
Transfiera los gránulos raspados y resuspendidos al mismo tubo de mini centrífuga de 1,5 mililitros. Realice la extracción de ARN viral de concentrados virales de muestras de aguas residuales y ensayos de eficiencia de recuperación utilizando un kit de extracción de ARN con una proporción de 25:24:2:1 de fenol a cloroformo a alcohol isoamílico y beta mercaptoetanol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Finalmente, eluye el ARN en 50 microlitros de tampón de elución.
Para el análisis RT-qPCR, cuantifique el ARN blindado utilizando diluciones diez veces mayores de una construcción sintética de ADN monocatenario o gBlock. Obtenga curvas de calibración para cada ejecución de RT-qPCR. Incluya controles negativos y ejecute las muestras por triplicado.
Recoja 10 litros de muestra ambiental de agua superficial. Incluye 10 litros de agua desionizada para el control del fondo. Realice filtración de cápsulas y vacío utilizando filtros de disco de membrana de tamaños de 0,45, 0,2 y 0,1 micras para minimizar el ruido durante la secuenciación metagenómica.
Después de la filtración, ajuste el pH de la muestra de agua a 3.5 usando un ácido clorhídrico normal. Prepare una solución de leche desnatada prefloculada al 1% y ajuste el pH a 3,5. Agregue 100 mililitros de la solución de leche desnatada acidificada a 10 litros de muestra de agua ambiental acidificada.
Revuelva la muestra durante ocho horas a temperatura ambiente en un agitador magnético y permita que las bandadas sedimenten por gravedad durante ocho horas adicionales. Después de asentarse, retire con cuidado el sobrenadante con una bomba de vacío sin molestar a los rebaños. Alícuota y equilibrar los rebaños restantes según el peso en un tubo centrífugo de 50 mililitros y centrífuga.
Retire el sobrenadante y disuelva el pellet en 200 microlitros de tampón fosfato de sodio 0,2 molar. Tratar los pellets disueltos con DNasa I y RNasa A siguiendo las instrucciones del fabricante para eliminar el ADN y el ARN libres coprecipitados durante el proceso de extracción. Después de la incubación, inactivar DNasa I y RNasa A.Extraiga ácidos nucleicos del pellet disuelto utilizando un kit de extracción de ADN o ARN.
Cuantifique la cantidad total de ADN o ARN extraído de la muestra de agua superficial ambiental utilizando un fluorómetro. Realizar análisis de qPCR para atacar virus entéricos de interés y secuenciación de Illumina para identificar la estructura de la comunidad viral. Recoja dos litros de muestras de agua de vías fluviales protegidas e impactadas.
Si la muestra contiene residuos considerables, use una gasa para eliminarlos. Agregue 20 mililitros de solución de leche desnatada al 1% a la muestra de agua dulce de dos litros previamente ajustada al pH. Revuelva la muestra durante ocho horas a temperatura ambiente y permita que las bandadas sedimenten por gravedad durante ocho horas adicionales.
Después de asentarse, retire con cuidado el sobrenadante con una bomba peristáltica. Transfiera las bandadas sedimentadas a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y centrifugarlas a 8, 000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Desechar el sobrenadante y resuspender los gránulos en 200 microlitros de tampón fosfato de sodio 0,2 molar.
Seleccione alrededor de 0,5 gramos de la parvada para la extracción de ADN utilizando el kit de aislamiento de ácidos nucleicos de su elección siguiendo las instrucciones del fabricante. Determine la concentración y pureza de ADN usando un fluorómetro. Las seis muestras procesadas con ultrafiltración a 3.000 G fueron positivas.
En contraste, solo una muestra fue positiva cuando las muestras se procesaron con ultrafiltración a 7, 500 G. Todas las muestras procesadas con SMF fueron positivas y resultaron en una mejor recuperación. Las tasas de recuperación promedio de 3, 000 G y SMF fueron significativa y consistentemente más altas que la ultrafiltración a 7, 500 G. Los parámetros de calidad del agua en muestras influenciadas y ácidos nucleicos extraídos de muestras de agua ambiental recolectadas dentro de Winnipeg a lo largo de tres temporadas se resumen aquí. Las muestras recolectadas de abril a octubre de 2022 del agua del río Assiniboine arrojaron la concentración más alta de ADN de Forested 1 y la concentración más baja se recuperó del sitio agrícola tres.
Es muy importante utilizar la concentración correcta de leche desnatada y acidificar la muestra antes de su uso. Esta técnica puede proporcionar una detección rápida de diferentes patógenos microbianos presentes en muestras ambientales como el agua y las aguas residuales. Se pueden implementar modificaciones adicionales utilizando matrices sólidas como suelo o sedimentos.
