Эпидемиология на основе воды и сточных вод стала альтернативным методом мониторинга и прогнозирования хода вспышек в сообществах. Метод флокуляции обезжиренного молока представляет собой альтернативный подход к концентрированию микробов. Метод флокуляции обезжиренного молока представляет собой универсальный, дешевый и простой метод концентрирования микробных фракций без существенных отличий по сравнению с ультрафильтрацией или тангенциальной фильтрацией потоком.
Этот подход используется для метагеномики или целевых ПЦР-исследований. После того, как микробные фракции сконцентрированы, экстракция нуклеиновых кислот может быть проведена с использованием коммерческих наборов для экстракции или внутреннего протокола. Метод флокуляции обезжиренного молока относительно проще для больших или малых объемов проб воды или сточных вод.
Фоновый контроль с водой Milli-Q должен быть включен как часть этого метода. Продемонстрируют процедуру Кадир Янак, Джаннелле Фрэнсис и Джоселин Самбрано-Альварадо, аспиранты лаборатории Мигеля Уягуари. Для начала соберите два литра 24-часовых пропорциональных композитных образцов неочищенных сточных вод.
Транспортируйте образцы в лабораторию в светонепроницаемых бутылках в холодильнике и обрабатывайте их в течение 24 часов. Получите данные о характеристиках сточных вод от технического персонала очистных сооружений. Для каждого метода ультрафильтрации пять раз от 10 до четвертых копий бронированной РНК в 140 миллилитров каждой из шести проб пресных сточных вод, собранных в одну дату, и шести проб свежих сточных вод в другую дату.
Гомогенизируйте бронированную РНК в образце, перемешивая в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия на магнитном перемешивании. Для флокуляции обезжиренного молока или SMF приготовьте 1%-ный раствор обезжиренного молока, растворив 0,5 грамма сухого обезжиренного молока в 50 миллилитрах синтетической морской воды. Отрегулируйте рН SMF до 3,5, используя одну нормальную соляную кислоту.
Добавьте пять миллилитров раствора обезжиренного молока к 500 миллилитрам образца сырых сточных вод. Перемешивайте образец в течение восьми часов и дайте образовавшимся стайкам отстояться еще восемь часов при комнатной температуре. Удаляют надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки, не тревожа осевшие стаи.
Конечный объем 50 миллилитров, содержащий стада, переносят в центрифужную пробирку и центрифугу при 8 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и аккуратно сотрите гранулы стерилизованным шпателем. Ресуспендировать оставшуюся гранулу в 250 микролитрах 0,2-молярного буфера фосфата натрия.
Переложите очищенные и ресуспендированные гранулы в ту же 1,5-миллилитровую мини-центрифужную пробирку. Выполните экстракцию вирусной РНК из вирусных концентратов образцов сточных вод и анализы эффективности восстановления с использованием набора для экстракции РНК с соотношением фенола и хлороформа 25:24:2:1, изоамилового спирта и бета-меркаптоэтанола в соответствии с инструкциями производителя. Наконец, разбавьте РНК в 50 микролитрах элюирующего буфера.
Для анализа ОТ-кПЦР количественно определите бронированную РНК с использованием десятикратных разведений синтетической одноцепочечной ДНК или конструкции gBlock. Получение калибровочных кривых для каждого запуска ОТ-кПЦР. Включите отрицательные элементы управления и запустите образцы в трех экземплярах.
Соберите 10 литров пробы поверхностных вод окружающей среды. Включите 10 литров деионизированной воды для фонового контроля. Выполняйте капсульную и вакуумную фильтрацию с использованием мембранных дисковых фильтров размером 0,45, 0,2 и 0,1 микрона, чтобы минимизировать шум во время метагеномного секвенирования.
После фильтрации отрегулируйте рН пробы воды до 3,5, используя одну нормальную соляную кислоту. Приготовьте 1%-ный предварительно флокулированный раствор обезжиренного молока и отрегулируйте рН до 3,5. Добавьте 100 миллилитров раствора подкисленного обезжиренного молока в 10 литров подкисленной пробы воды из окружающей среды.
Перемешивайте образец в течение восьми часов при комнатной температуре на магнитном шейкере и дайте стадам осаждаться под действием силы тяжести еще восемь часов. После отстаивания аккуратно удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумного насоса, не тревожа стаи. Аликвотируйте и уравновешивайте оставшиеся стада в соответствии с весом в 50-миллилитровой центрифужной пробирке и центрифуге.
Удалите надосадочную жидкость и растворите гранулу в 200 микролитрах 0,2-молярного буфера фосфата натрия. Обработайте растворенные гранулы ДНКазой I и РНКазой А в соответствии с инструкциями производителя по удалению свободной ДНК и РНК, осажденных в процессе экстракции. После инкубации инактивируйте ДНКазу I и РНКазу А. Извлеките нуклеиновые кислоты из растворенной гранулы с помощью набора для экстракции ДНК или РНК.
Количественно определите общее количество извлеченной ДНК или РНК из образца поверхностных вод окружающей среды с помощью флуорометра. Проведите анализ кПЦР для нацеливания на интересующие кишечные вирусы и секвенирование Illumina для определения структуры вирусного сообщества. Соберите два литра проб воды из защищенных и пострадавших водных путей.
Если образец содержит значительный мусор, используйте марлю для его удаления. Добавьте 20 миллилитров 1%-ного раствора обезжиренного молока в предварительно скорректированный двухлитровый образец пресной воды с корректировкой pH. Перемешивайте образец в течение восьми часов при комнатной температуре и дайте стадам осаждаться под действием силы тяжести еще восемь часов.
После отстаивания аккуратно удалите надосадочную жидкость с помощью перистальтического насоса. Перенесите осажденные стада в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте их при 8 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы в 200 микролитрах 0,2-молярного буфера фосфата натрия.
Выберите около 0,5 грамма стада для экстракции ДНК, используя выбранный набор для выделения нуклеиновых кислот, следуя инструкциям производителя. Определите концентрацию и чистоту ДНК с помощью флуорометра. Все шесть образцов, обработанных ультрафильтрацией при 3 000 G, были положительными.
Напротив, только один образец был положительным, когда образцы были обработаны ультрафильтрацией при 7 500 г. Все образцы, обработанные с помощью SMF, были положительными и приводили к лучшему восстановлению. Средняя скорость извлечения 3 000 г и SMF была значительно и неизменно выше, чем ультрафильтрация при 7 500 г. Параметры качества воды в образцах под влиянием и нуклеиновых кислотах, извлеченных из проб воды окружающей среды, собранных в Виннипеге в течение трех сезонов, приведены здесь. Образцы, собранные с апреля по октябрь 2022 года из воды реки Ассинибойн, дали самую высокую концентрацию ДНК из Forested 1, а самая низкая концентрация была извлечена из третьего сельскохозяйственного участка.
Очень важно использовать правильную концентрацию обезжиренного молока и подкислить образец перед использованием. Этот метод может обеспечить быстрый скрининг различных микробных патогенов, присутствующих в образцах окружающей среды, таких как вода и сточные воды. Дополнительные модификации могут быть реализованы с использованием твердых матриц, таких как почва или отложения.
