水ベースおよび廃水疫学は、コミュニティでの発生の経過を監視および予測するための代替方法として浮上しています。スキムミルク凝集法は、微生物を濃縮するための代替アプローチです。スキムミルク凝集法は、限外ろ過または接線流ろ過アプローチと比較して大きな違いなしに微生物画分を濃縮するための、用途が広く、安価で、簡単なハンズオフ方法です。
このアプローチは、メタゲノミクスまたはターゲットPCR研究に使用されます。微生物画分が濃縮されると、市販の抽出キットまたは社内プロトコルを使用して核酸抽出を行うことができます。スキムミルク凝集法は、大量または少量の水または廃水サンプルに対して比較的簡単です。
この方法の一部として、Milli-Q水を使用したバックグラウンドコントロールを含める必要があります。手順を実演するのは、ミゲル・ウヤグアリの研究室の大学院生であるカディール・ヤナック、ジャネル・フランシス、ジョセリン・ザンブラノ・アルバラドです。まず、2リットルの24時間流量比例複合生廃水サンプルを収集します。
サンプルをアイスボックス内の遮光ボトルに入れて実験室に輸送し、24時間以内に処理します。廃水処理プラントの技術スタッフから排水特性データを取得します。限外ろ過法ごとに、装甲RNAの10から4番目のコピーを、ある日に収集された6つの新鮮な廃水サンプルと別の日に収集された6つの新鮮な廃水サンプルのそれぞれ140ミリリットルに5回スパイクします。
磁気攪拌で摂氏4度で30分間攪拌することにより、サンプル中の装甲RNAをホモジナイズします。スキムミルク凝集またはSMFの場合は、0.5グラムのスキムミルク粉末を50ミリリットルの合成海水に溶解して、1%スキムミルク溶液を調製します。SMFのpHを1つの通常の塩酸を使用して3.5に調整します。
500ミリリットルの生廃水サンプルに5ミリリットルのスキムミルク溶液を追加します。サンプルを8時間攪拌し、形成された群れを室温でさらに8時間沈降させます。落ち着いた群れを乱すことなく血清学的ピペットを使用して上清を除去します。
群れを含む50ミリリットルの最終容量を遠沈管に移し、8, 000 Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。上清を取り除き、滅菌したヘラを使用してペレットを慎重に廃棄します。残りのペレットを250マイクロリットルの0.2モルリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁する。
掻き取り、再懸濁したペレットを同じ1.5ミリリットルのミニ遠心管に移します。製造元の指示に従って、フェノールとクロロホルム、イソアミルアルコール、およびベータメルカプトエタノールの比率が25:24:2:2:1のRNA抽出キットを使用して、廃水サンプルのウイルス濃縮物からのウイルスRNA抽出と回収効率アッセイを実行します。最後に、50マイクロリットルの溶出バッファーでRNAを溶出します。
RT-qPCR分析では、合成一本鎖DNAまたはgBlockコンストラクトの10倍希釈液を用いて装甲RNAを定量します。各RT-qPCR実行の検量線を取得します。ネガティブコントロールを含め、サンプルを三重に実行します。
10リットルの環境地表水サンプルを収集します。バックグラウンドコントロールのために10リットルの脱イオン水を含めます。0.45、0.2、および0.1ミクロンサイズのメンブレンディスクフィルターを使用してカプセルおよび真空ろ過を実行し、メタゲノミクスシーケンシング中のノイズを最小限に抑えます。
ろ過後、通常の塩酸1本を使用して水サンプルのpHを3.5に調整します。1%事前に凝集したスキムミルク溶液を調製し、pHを3.5に調整します。100ミリリットルの酸性化脱脂乳溶液を10リットルの酸性化環境水サンプルに加えます。
マグネティックシェーカーでサンプルを室温で8時間攪拌し、さらに8時間重力によって群れを沈降させます。沈降後、群れを乱さずに真空ポンプを使用して上澄み液を慎重に除去します。50ミリリットルの遠沈管と遠心分離機で重量に応じて残りの群れを分注し、バランスを取ります。
上清を除去し、ペレットを200マイクロリットルの0.2モルリン酸ナトリウム緩衝液に溶解する。溶解したペレットを製造元の指示に従ってDNase IおよびRNase Aで処理し、抽出プロセス中に共沈した遊離DNAおよびRNAを除去します。インキュベーション後、DNase IおよびRNase A.DNAまたはRNA抽出キットを使用して、溶解したペレットから核酸を抽出します。
蛍光光度計を使用して、環境表層水サンプルから抽出されたDNAまたはRNAの総量を定量します。qPCR分析を実行して目的の腸内ウイルスを標的とし、イルミナシーケンシングを実行してウイルス群集構造を特定します。保護され影響を受けた水路から2リットルの水サンプルを収集します。
サンプルにかなりの破片が含まれている場合は、チーズクロスを使用してそれらを取り除きます。20ミリリットルの1%スキムミルク溶液を、以前にpH調整した2リットルの淡水サンプルに追加します。サンプルを室温で8時間攪拌し、さらに8時間重力によって群れを沈降させます。
沈降後、蠕動ポンプを使用して上清を慎重に除去します。沈殿したフロックを50ミリリットルの遠沈管に移し、8, 000 Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを200マイクロリットルの0.2モルリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁します。
製造元の指示に従って、選択した核酸分離キットを使用して、DNA抽出用の約0.5グラムの群れを選択します。蛍光光度計を使用してDNA濃度と純度を測定します。3, 000 Gの限外ろ過で処理された6つのサンプルはすべて陽性でした。
対照的に、サンプルを7, 500 Gの限外ろ過で処理した場合、1つのサンプルのみが陽性であり、SMFで処理されたすべてのサンプルは陽性であり、より良い回収をもたらしました。3, 000 GとSMFの平均回収率は、7, 500 Gでの限外ろ過よりも有意かつ一貫して高かった。2022年4月から10月にアシニボイン川の水から収集されたサンプルは、森林1から最も高いDNA濃度をもたらし、最低濃度は農業サイト3から回収されました。
使用前に適切な濃度のスキムミルクを使用し、サンプルを酸性化することが非常に重要です。この技術は、水や廃水などの環境サンプルに存在するさまざまな微生物病原体の迅速なスクリーニングを提供できます。追加の変更は、土壌や堆積物などの固体マトリックスを使用して実装できます。
