儿茶酚胺能多形性室性心动过速的 RyR2^R2474S 敲入小鼠心脏的双染料光学映射

该方法将有助于我们揭示与儿茶酚胺能多形性室性心动过速等疾病相关的心室停搏涂片的电生理特性和机制。利用该技术，我们可以在各种程序化的电起搏方案下同时获得膜电位和细胞间钙信号，特别适用于探索心律失常疾病（如CPVT）的潜在机制和动力学。为了成功进行此实验，请确保心脏灌注良好，适当的染料加载，激发-收缩解偶联和仔细的相机设置。

首先，设置光学映射系统并打开相机，以在零下 50 摄氏度下稳定采样温度。将收获的小鼠心脏放入冷的CREB溶液中，以减缓新陈代谢并保护心脏。切除主动脉周围组织。

使用定制的插管针进行插管，并用 4-0 丝线缝合固定。现在用Langendorff系统以每分钟3.5至4.0毫升的恒定速度灌注心脏。将一根小塑料管插入左心室，以释放腔室中溶液的充血，以避免过度预负荷，并将塑料管固定在插管针中。

然后将两根导线放入浴槽的灌注液中，并打开心电图放大器盒和电刺激控制器的电源。接下来，启动参考的心电图或心电图软件并持续监测心电图。当心脏达到稳定状态时，在黑暗中执行后续步骤。

将 blebbistatin CREBs 溶液混合物持续灌注到心脏中 10 分钟，以解除收缩与兴奋的耦合，并避免拍摄过程中出现收缩伪影。然后用红色手电筒检查心脏，确认宫缩完全停止。解偶联兴奋收缩后，在Langendorff灌注系统中用Rhod-2 AM工作溶液灌注心脏15分钟。

在细胞内钙染料加载期间维持氧气供应。为防止多元 F-127 形成气泡，请在灌注系统中插入气泡捕集器。将 10 微升 RH 237 储备溶液稀释到 50 毫升灌注液中，并加载 10 分钟。

完成双染料加载后，拍摄一系列照片。确认电压和钙信号足以进行分析。打开激发灯的两个 LED 并将其强度调整到适当的范围。

将心脏放在检测设备下方，确保它被两个 LED 很好地照亮，将光斑直径调整到 2 厘米。将晶状体和心脏之间的工作距离设置为 10 厘米，以达到所需的采样率和空间分辨率。打开信号采样软件，同时控制相机并捕获电压和钙信号。

启动 MyoPacer 场刺激器并将起搏模式设置为晶体管晶体管逻辑，每个脉冲的起搏持续时间为 2 毫秒。将初始强度设置为 0.3 伏。将一对铂电极连接到左心室顶点的心外膜上。

使用心电图记录软件连续应用 30 次 10 赫兹 S1 刺激来测试心脏的舒张压阈值。逐渐增加电压幅度，直到实现一对一捕获。实施 S1-S1 方案以测量钙或动作电位替代物和恢复特性。

从 100 毫秒的基本周期长度开始连续起搏心脏。在每个后续序列中将周期长度减少 10 毫秒，直到达到 50 毫秒。在刺激之前同时启动光学映射。

要使用 S1-S2 刺激方案测量心室有效不应期，请从 100 毫秒的 S1-S1 起搏周期长度开始。在 60 毫秒处耦合 S2，并以 2 毫秒的步长递减递减，直到 S2 无法捕获异位 QRS 波群。对于心律失常诱发，给予永久 50 赫兹的突发起搏，并在等待两秒的休息间隔后进行相同的起搏发作。

在连续高频起搏期间仔细监测心电图记录，以便在产生有趣的心律失常波时立即开始同步光学映射记录。继续使用电子倍增电荷耦合器件相机捕获图像。在图像采集软件中，按选择文件夹，加载图像，开始半自动海量视频数据分析过程。

为分析输入正确的采样参数。手动设置图像阈值并选择感兴趣的区域。应用 3 x 3 像素高斯空间滤波器、Savitzky-Golay 滤波器和顶帽基线校正。

然后按处理图像删除基线并计算电生理参数，如 APD-80 和 CATD-50。将起始时间、电位持续时间设置在峰值和终点处，在80%复极化处，用于计算APD-80。同样，将钙瞬态持续时间的开始时间定义为峰值，终点为80%弛豫。

显示了 APD-80 和 CATD-80 热图中的典型迹线。异丙肾上腺素缩短了APD-80和野生型和儿茶酚胺能多形性室性心动过速或CPVT小鼠，但在异丙肾上腺素攻击后未发现差异。CATD-80 和 CPVT 小鼠在异丙肾上腺素攻击后比野生型更长，而治疗前没有显着性。

根据电压信号，野生型和CPVT心脏在基线和异丙肾上腺素干预后对心外膜具有相同的传导能力。热图表明，CPVT小鼠在异丙肾上腺素攻击前后具有与野生型小鼠相同的传导能力。钙振幅交替分析显示，在14.29和16.67赫兹的连续S1-S1起搏期间，野生型心脏的钙信号在基线时保持稳定，而CPVT心脏则表现出频率依赖替。

异丙肾上腺素激发后，CPVT心脏在S1-S1起搏期间表现出频率依赖替和钙信号，而野生型心脏不受影响。心动过速分析表明，在基线时 50 赫兹爆发起搏期间，野生型和 CPVT 心脏均表现出正常传导。在充满异丙肾上腺素后，CPVT心脏在50赫兹爆发起搏后表现出高频转子，而野生型心脏保持正常传导。

按照该程序，使用雄激素型和野生型小鼠来说明这些模型或药物发明中的电生理和功能特性。光学标测是研究心律失常的有力工具，但由于荧光染料在激发收缩解偶联作用下的限制，它不能在临床上使用。随着高转计算技术的发展，针对不同目标分子的荧光技术的发展，心脏光学标测技术势必只能得到应用。