カテコールアミン作動性多形性心室頻拍の RyR2^R2474S ノックインマウスの心臓の二重色素光学マッピング

この方法は、カテコールアミン作動性多形性心室頻拍などの疾患に関連する心室停止塗抹標本の電気生理学的特性とメカニズムを明らかにするのに役立ちます。この技術を用いることで、様々なプログラムされた電気ペーシングプロトコルで膜電位と細胞間カルシウムシグナルを同時に得ることができ、CPVTなどの不整脈疾患の根底にあるメカニズムや動態を探るのに特に適しています。この実験を成功させるには、心臓の灌流が良好であること、適切な色素のローディング、励起収縮のアンカップリング、および慎重なカメラ設定が必要です。

まず、光学マッピングシステムをセットアップし、カメラの電源を入れて、摂氏マイナス50度の安定したサンプリング温度を実現します。採取したマウスの心臓を冷たいCREB溶液に入れて、代謝を遅らせ、心臓を保護します。大動脈の周囲の組織を取り除きます。

カスタムメイドのカニューレ針を使用してカニューレを挿入し、4-0シルク縫合糸で固定します。次に、毎分3.5〜4.0ミリリットルの一定速度でランゲンドルフシステムを使用して心臓を灌流します。小さなプラスチックチューブを左心室に挿入してチャンバー内の溶液のうっ血を解放し、過負荷を回避し、プラスチックチューブをカニューレ挿入針に固定します。

次に、2本のリード線をバスの灌流液に入れ、心電図増幅器ボックスと電気刺激コントローラーの電源をオンにします。次に、参照される心電図またはECGソフトウェアを起動し、ECGを継続的に監視します。心臓が安定した状態に達したら、暗闇の中で次のステップを実行します。

ブレビスタチンCREBs溶液混合物を心臓に10分間絶えず灌流して、収縮と興奮を切り離し、撮影中の収縮アーチファクトを回避します。次に、赤い懐中電灯を使用して心臓を調べ、収縮が完全に停止することを確認します。励起収縮を切り離した後、ランゲンドルフ灌流システムでRhod-2 AM作業溶液で心臓を15分間灌流します。

細胞内カルシウム色素のローディング中に酸素供給を維持します。プルロニックF-127による気泡形成を防ぐために、気泡トラップを灌流システムに挿入します。10マイクロリットルのRH 237ストック溶液を50ミリリットルの灌流液に希釈し、10分間ロードします。

デュアル染料のローディングが完了したら、一連の写真をキャプチャします。電圧信号とカルシウム信号が解析に適していることを確認してください。励起光用の2つのLEDを点灯させ、その強度を適切な範囲に調整します。

心臓を検出装置の下に置き、光点の直径を2センチメートルに調整する2つのLEDによって心臓が十分に照らされていることを確認します。レンズと心臓の間の作動距離を10センチメートルに設定して、目的のサンプリングレートと空間分解能を実現します。信号サンプリングソフトウェアを開き、カメラの制御と電圧信号とカルシウム信号のキャプチャを同時に行います。

MyoPacer Field Stimulator を起動し、ペーシングパターンをトランジスタトランジスタロジックに設定し、パルスごとに 2 ミリ秒のペーシング期間を設定します。初期強度を 0.3 ボルトに設定します。左心室の心外膜に取り付けられた一対の白金電極を配置します。

10ヘルツのS1刺激を30回連続して適用し、ECG記録ソフトウェアを使用して心臓の拡張期電圧しきい値をテストします。1対1のキャプチャが得られるまで、電圧振幅を徐々に増やします。S1-S1プロトコルを実装して、カルシウムまたは活動電位の代替物と反発特性を測定します。

100ミリ秒の基本サイクル長から順番に心臓のペースを刻みます。サイクル長が 50 ミリ秒に達するまで、後続の各シーケンスで 10 ミリ秒ずつ減らします。刺激の前に同時に光学マッピングを開始します。

S1-S2刺激プロトコルを使用して心室有効耐火期間を測定するには、S1-S1ペーシングサイクル長を100ミリ秒から開始します。S2を60ミリ秒で結合し、S2が異所性QRS複合体を捕捉できなくなるまで、2ミリ秒刻みで減少させます。不整脈誘発の場合は、50ヘルツバーストペーシングを永続的に投与し、2秒間の休息間隔を待った後、同じペーシングエピソードを実行します。

連続的な高周波ペーシング期間中の心電図記録を注意深く監視し、興味深い不整脈波が発生したときに同時に光マッピング記録を速やかに開始します。電子増倍電荷結合素子カメラを使用して画像を撮影します。画像取得ソフトウェアで、フォルダ選択を押し、画像を読み込むと、半自動の大量ビデオデータ解析プロセスが開始されます。

解析の正しいサンプリングパラメータを入力します。画像のしきい値を手動で設定し、関心領域を選択します。3 x 3 ピクセルのガウス空間フィルター、Savitzky-Golay フィルター、シルクハットベースライン補正を適用します。

次に、[画像の処理]を押してベースラインを削除し、APD-80やCATD-50などの電気生理学的パラメータを計算します。APD-80を計算するために、ピークでの活動電位時間の開始時間と80%の再分極での終点を設定します。同様に、カルシウム過渡期間の開始時間をピークとして定義し、終点を 80% 緩和します。

APD-80 と CATD-80 のヒートマップの典型的なトレースを示します。イソプロテレノールは、APD-80および野生型およびカテコールアミン作動性多形性心室頻拍またはCPVTマウスを短縮しますが、イソプロテレノールチャレンジ後に差は見られませんでした。CATD-80およびCPVTマウスは、イソプロテレノールチャレンジ後、野生型よりも期間が長かったが、治療前は有意性がなかった。

電圧信号によると、野生型とCPVTの心臓は、ベースライン時とイソプロテレノール介入後に心外膜を横切る同じ伝導能力を持っていました。ヒートマップは、CPVTマウスがイソプロテレノールチャレンジの前後で野生型マウスと同じ伝導能を持つことを示しました。カルシウム振幅代替分析では、野生型心臓のカルシウムシグナルは、14.29ヘルツと16.67ヘルツで連続したS1-S1ペーシング中にベースラインで安定していたが、CPVT心臓は周波数依存的な代替を示した。

イソプロテレノールチャレンジ後、CPVT心臓はS1-S1ペーシング中に周波数依存性交互およびカルシウムシグナルを示したが、野生型心臓は影響を受けなかった。頻変性不整脈解析では、野生型とCPVTの両方の心臓が、ベースラインでの50ヘルツバーストペーシング中に正常な伝導を示すことが示唆されました。イソプロテレノールを多量に投与した後、CPVT心臓は50ヘルツバーストペーシング後に高周波ローターを示しましたが、野生型心臓は正常な伝導を維持しました。

この手順に続いて、アドゲン型および野生型マウスを用いて、これらのモデルまたは医薬品の発明における電気生理学的および機能的特性を例示する。光学マッピングは、不整脈を研究するための強力なツールですが、励起収縮の結合解除下での蛍光色素の制限により、臨床的に使用することはできません。高回転計算技術の開発による異なる標的分子に適した蛍光の開発により、心臓光学マッピング技術はアプリケーションのみを達成するためにバインドされています。