在大鼠模型中使用低强度聚焦超声破坏血脊髓屏障

血脊髓屏障紧密结合，通透性有限。该协议允许研究人员使用微气泡和聚焦超声安全、短暂地打开血脊髓屏障。该技术允许血脊髓屏障开口定位到目标脊髓节段。

此外，可以通过目视观察或荧光显微镜轻松确认破坏。可以探索该协议在改善基因疗法或药物向脊髓的递送以治疗肿瘤、萎缩或损伤方面的潜力。演示该程序的是 Meghana Bhimreddy。

我实验室的一位出色的医学博士生，每天都在弥合工程和医学之间的差距。首先，购买一个聚焦的超声换能器系统，其规格足以在大鼠中实现血脊髓屏障或BSCB开口。将 3D 打印的探头支架和水锥固定在换能器上。

确保锥体和换能器之间有防水密封。使用橡皮筋将灭菌的 50 微米厚、透声的聚酯膜固定在水锥底部。使用进水管和出水管用脱气和去离子水填充水锥。

避免锥体内有气泡，因为它们会破坏换能器和目标之间的声耦合。在这个阶段，聚酯薄膜应略微膨胀。将包含波发生器和射频驱动放大器的驱动设备连接到换能器。

将立体定向臂固定在固定板上，并将探头支架连接到臂上。记录麻醉的Sprague-Dawley雌性大鼠的体重，并进行脚趾和尾巴捏合试验，以确认麻醉。将加热垫和无菌吸收垫放在固定板上。

将大鼠放在吸收垫上。涂抹眼药膏并放置直肠温度计以监测体温。触诊大鼠的最后一根肋骨，该肋骨附着在第13胸椎的脊柱上。

使用电动剃须刀剃掉最后一根肋骨和颈部之间背部表面的毛发。用蘸有10%碘泊酮的纱布擦拭暴露的皮肤。使用虹膜剪刀创建一个中线切口，并解剖筋膜，直到暴露棘突和椎板。

用偏置骨钳和倾斜的刀片虹膜剪刀去除骨头，直到脊髓暴露在外。通过夹紧与椎板切除术相邻的棘突将大鼠固定在固定板上。然后轻轻拉动夹子，使脊柱绷紧。

用立体定向臂调整换能器的位置，直到它位于椎板切除术的正上方。将激光设备固定在水锥底部并降低，直到看到激光点。然后调整换能器的横向位置，直到激光点高于目标位置以进行 BSCB 破坏。

取下激光装置，用脱气的超声凝胶填充锥体和脊髓之间的空间，不要引入气泡。在换能器功率输出上设置超声处理参数。根据制造商的说明准备微泡溶液。

为了增加尾静脉导管插入术成功的机会，将尾巴浸入温水中，并在尾巴底部放置止血带以扩大静脉直径。然后插入一根 22 号尾静脉导管，并用 0.2 毫升肝素化盐水冲洗。每公斤注射一毫升 3% Evans Blue Dye 或 EBD 到导管中。

然后用 0.2 毫升肝素化盐水冲洗导管。通过检查大鼠皮肤，眼睛或脊髓背静脉的蓝色变化来确认尾静脉导管插入术是否成功。在开始超声处理之前，将 0.2 毫升微泡团注射到导管中并用肝素化盐水冲洗。

对大鼠实施安乐死后，取出脊髓并将其置于4%多聚甲醛中，在4摄氏度下过夜。第二天用PBS代替多聚甲醛。为了可视化BSCB的破坏，使用剃须刀片在超声处理位置周围隔离两厘米的部分。

使用切片机将切片分成 10 微米厚的切片，并用苏木精伊红染色染色。对于荧光显微镜，将含有脊髓切片的载玻片脱蜡，并用溶解在封固剂中的25微升DAPI进行复染。将切片在 4 摄氏度的黑暗中孵育 10 分钟，以防止漂白。

孵育后，使用荧光显微镜对所有载玻片进行成像。使用光学显微镜对苏木精和伊红染色的载玻片进行成像。椎板切除术后可见脊髓脉管系统，显示脊髓后静脉，有多条较小的血管向外侧放射。

静脉注射EBD后，周围组织和脊髓脉管系统呈蓝色。超声处理后，在目标位置上可见一个蓝点，表明由于 BSCB 破坏，EBD 外渗到白色实质中。用低强度聚焦超声或LIFU超声检查切除大鼠脊髓，证实EBD明显外渗到脊髓中。

而未进行LIFU治疗的阴性对照大鼠未显示EBD外渗。与未接受超声处理的脊髓相比，接受 LIFU 超声处理的脊髓显示出明显更高的 EBD 自发荧光强度。两者中都存在相似强度的 DAPI。

苏木精和伊红分析显示超声处理部位无神经元损伤、出血或空腔病变。比较显示了由于手术处理不当和高倍超声处理而导致的脊髓损伤示例。在接受微泡和LIFU治疗的大鼠中，观察到运动评分，超声处理前，超声处理后和五天生存期内没有变化。

在超声处理分析之前、期间和之后观察到脊髓温度的最小变化。在椎板切除术期间限制脊髓的手术损伤很重要。用显微镜观察 H 和 E 染色切片，将指示是否发生了任何损伤。

在血脊髓屏障破坏后，使用聚焦超声，可以给动物注射抗肿瘤药物或基因疗法。结果将决定该技术是否可以改善治疗的交付，并延长脊髓病理学环境中的生存期。