Kan-omurilik bariyeri sıkı sıkıya bağlıdır ve sınırlı geçirgenliğe sahiptir. Bu protokol, araştırmacıların mikro kabarcıklar ve odaklanmış ultrason kullanarak kan-omurilik bariyerini güvenli ve geçici olarak açmalarını sağlar. Bu teknik, kan-omurilik bariyeri açıklığının hedeflenen omurilik segmentine lokalize edilmesini sağlar.
Ek olarak, bozulma görsel gözlem veya floresan mikroskobu ile kolayca doğrulanabilir. Bu protokol, tümörlerin, atrofinin veya yaralanmanın tedavisi için gen terapilerinin veya ilaçların omuriliğe verilmesini iyileştirme potansiyeli açısından araştırılabilir. Prosedürü gösteren Meghana Bhimreddy olacak.
Laboratuvarımdan her gün mühendislik ve tıp arasındaki boşluğu dolduran yıldız bir MD öğrencisi. Başlamak için, sıçanlarda kan-omurilik bariyeri veya BSCB açıklıkları elde etmek için yeterli özelliklere sahip odaklanmış bir ultrason dönüştürücü sistemi edinin. 3D baskılı prob tutucuyu ve su konisini dönüştürücüye yapıştırın.
Koni ve dönüştürücü arasında su geçirmez bir conta olduğundan emin olun. Sterilize edilmiş, 50 mikron kalınlığında, akustik olarak şeffaf, polyester membranı bir lastik bant kullanarak su konisinin dibine sabitleyin. Giriş ve çıkış borularını kullanarak su konisini gazdan arındırılmış ve deiyonize suyla doldurun.
Dönüştürücü ve hedef arasındaki akustik bağlantıyı bozabileceğinden, koninin içindeki hava kabarcıklarından kaçının. Bu aşamada, Mylar zarı hafifçe şişirilmelidir. Dalga üreteci ve radyo frekansı sürücü amplifikatörünü içeren tahrik ekipmanını dönüştürücüye bağlayın.
Stereotaktik kolu sabitleme plakasına sabitleyin ve prob tutucuyu kola takın. Anestezi uygulanmış bir Sprague-Dawley dişi sıçanının ağırlığını kaydedin ve anesteziyi doğrulamak için ayak parmağı ve kuyruk tutam testi yapın. Sabitleme plakasına bir ısıtma yastığı ve steril emici ped yerleştirin.
Fareyi emici pedin üzerine yerleştirin. Göz merhemi sürün ve vücut ısısını izlemek için rektal bir termometre yerleştirin. 13. torasik omurlarda omurgaya bağlı olan sıçanın son kaburgasını palpe edin.
Son kaburga ile boyun arasındaki sırt yüzeyindeki kürkü tıraş etmek için elektrikli bir tıraş bıçağı kullanın. Maruz kalan cildi% 10 iyodopovidon içine batırılmış gazlı bezle silin. İris makası kullanarak bir orta hat kesisi oluşturun ve dikenli süreçler ve lamina ortaya çıkana kadar fasya boyunca diseksiyon yapın.
Omurilik açığa çıkana kadar kemiği ofset kemik pense ve açılı bıçaklı iris makası ile çıkarın. Laminektomiye bitişik dikenli işlemleri sıkıştırarak sıçanı sabitleme plakasına sabitleyin. Ardından omurgayı gergin hale getirmek için kelepçeleri hafifçe çekin.
Transdüserin konumunu, laminektominin tam üzerine gelene kadar stereotaktik kolla ayarlayın. Lazer aparatını su konisinin altına takın ve lazer noktası görünene kadar indirin. Ardından, lazer noktası BSCB bozulması için hedef konumun üzerine çıkana kadar dönüştürücünün yanal konumunu ayarlayın.
Lazer aparatını çıkarın ve koni ile omurilik arasındaki boşluğu hava kabarcıkları oluşturmadan gazdan arındırılmış ultrason jeli ile doldurun. Dönüştürücü güç çıkışında sonikasyon için parametreleri ayarlayın. Üreticinin talimatlarına göre bir mikro kabarcık çözeltisi hazırlayın.
Başarılı kuyruk damar kateterizasyonu şansını artırmak için kuyruğu ılık suya batırın ve damar çapını büyütmek için kuyruğun tabanına bir turnike yerleştirin. Ardından 22 gauge kuyruk ven kateteri yerleştirin ve 0.2 mililitre heparinize salin ile yıkayın. Kateterin kilogramı başına bir mililitre% 3 Evans Mavi Boya veya EBD enjekte edin.
Ardından kateteri 0.2 mililitre heparinize salin ile yıkayın. Sıçanın cildinde, gözlerinde veya dorsal spinal damarında mavi renk değişikliği olup olmadığını kontrol ederek başarılı kuyruk veni kateterizasyonunu onaylayın. Kateter içine 0.2 mililitre bolus mikrokabarcık enjekte edin ve sonikasyona başlamadan önce heparinize salin ile yıkayın.
Sıçanı ötenazi yaptıktan sonra, omuriliği çıkarın ve gece boyunca dört santigrat derecede% 4 paraformaldehit içine yerleştirin. Ertesi gün paraformaldehiti PBS ile değiştirin. BSCB bozulmasını görselleştirmek için, bir tıraş bıçağı kullanarak sonikasyon yerini çevreleyen iki santimetrelik bir bölümü izole edin.
Kesiti bir mikrotom kullanarak 10 mikron kalınlığında bölümlere ayırın ve hematoksilen eozin boyası ile boyayın. Floresan mikroskobu için, omurilik bölümünü içeren slaydı deparafinize edin ve montaj ortamında çözülmüş 25 mikrolitre DAPI ile karşı boyayın. Ağartmayı önlemek için bölümleri karanlıkta 10 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, tüm slaytları görüntülemek için bir floresan mikroskobu kullanın. Hematoksilen ve eozin lekeli slaydı bir ışık mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Omurilik damar sistemi laminektomiden sonra görülebilir ve posterior spinal veni gösterir ve lateral olarak yayılan çok sayıda küçük damar bulunur.
EBD'nin intravenöz enjeksiyonundan sonra, çevre doku ve omurilik damar sistemi mavi görünüyordu. Sonikasyondan sonra, BSCB bozulması nedeniyle EBD'nin beyaz parankime ekstravazasyonunu gösteren mavi bir nokta hedeflenen konum üzerinde görünür hale gelir. Düşük yoğunluklu odaklanmış ultrason veya LIFU sonikasyonu ile sıçanlardan eksize edilen omurilik, EBD'nin omuriliğe belirgin ekstravazasyonunu doğruladı.
LIFU tedavisi olmayan negatif kontrollü sıçanlarda EBD ekstravazasyonu görülmedi. LIFU sonikasyonlu omurilikler, sonikasyon almayan kordonlardan önemli ölçüde daha fazla EBD otofloresan yoğunluğu gösterdi. Her ikisinde de benzer DAPI yoğunlukları var.
Hematoksilen ve eozin analizi, sonikasyonlu yerlerde nöronal hasar, kanama veya kavite lezyonu göstermedi. Cerrahi yanlış kullanım nedeniyle yaralı kordon örnekleri ve yüksek güçlü sonikasyon bir karşılaştırma olarak gösterilmiştir. Mikro kabarcıklar ve LIFU tedavisi alan sıçanlarda, motor skorlarında, sonikasyon öncesi, sonikasyon sonrası ve beş günlük sağkalım süresi boyunca herhangi bir değişiklik gözlenmedi.
Sonikasyon analizi öncesinde, sırasında ve sonrasında omurilik sıcaklığında minimal değişiklikler gözlendi. Laminektomi sırasında kordun cerrahi hasarını sınırlamak önemlidir. H ve E boyalı bölümlerin mikroskopi ile görüntülenmesi, herhangi bir hasar olup olmadığını gösterecektir.
Kan-omurilik bariyerinin bozulmasını takiben, odak ultrasonu kullanılarak, hayvanlara antineoplastik ajanlar veya gen terapileri enjekte edilebilir. Sonuç, bu tekniğin terapötiklerin verilmesini iyileştirip iyileştiremeyeceğini ve omurilik patolojisi ortamında sağkalımı uzatıp uzatamayacağını belirleyecektir.
